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【摘要】 目的 探讨糖尿病大鼠主动脉中p53、c-jun基因mRNA表达及其TGF-β1抑制剂对其表达的影响。方法 链脲左菌素糖尿病大鼠随机分为对照组、联合干预组、维生素E组、氯沙坦、氨基胍组5组。联合干预组用Vitamin E［10 mg/（kg·d）］、Losartan［10 mg（kg·d）］、AG［50 mg/（kg·d）］，蒸馏水稀释至5 ml，一次性灌胃，对照组用5 ml蒸馏水，其他组按同样的方法分别处理，共饲养12周。用逆转录聚合酶链式反应检测基因的表达水平。结果 STZ大鼠主动脉中，p53、c-jun基因有明显的高表达，较正常组差异有显著性（P<0.05）。治疗12周后，p53、c-jun基因在实验组中表达明显减弱，与对照组差异有显著性（P<0.05）。结论 抑癌基因p53和原癌基因c-jun可能与糖尿病大鼠大血管病变有关，多途径干预TGF-β1可以抑制p53、c-jun基因表达，延缓大血管病变形成。
【关键词】 转移生长因子β1；p53基因；c-jun基因；糖尿病大鼠；血管并发症
Influence of mutiple inhibitors of TGF-β1 on p53,c-jun gene expression in aortic vascular smooth muscle of rats with diabetes
XIANG Qian,WANG Fang,LIU Hong,et al.Nanshan Hospital of Shenzhen,Shenzhen 518051,China
［Abstract］ Objective To study the expression of p53 and c-jun gene in the arteria maxima Galeni of streptozotocin（STZ）-induced diabetic rats,and the influence of the inhibitors of TGF-β1 on the mRNA expression.Methods Diabetic rats were randomly divided into 5 groups,they were contract group,combine interference,vitamin E group,losartan and aminoguanidine （AG）group.The interference group was taken orally once a day with 5ml solution which consisted of vitamin E［10 mg/（kg·d）］，losartan［10 mg/（kg·d）］and AG［50 mg/（kg·d）］.Contrast group was taken 5ml distilled water.Other groups were respectively taken vitamin E or losartan or aminoguanidine.The time was 12 weeks.The expression was examined by RT-PCR.Results P53 and c-jun gene expressed obviously in contrast group,which had evidently difference comparing to combine interference group（P<0.01）.There was no evidently difference among the 3 other groups,but their expression of p53 and c-jun gene was higher than combine group （P<0.05），but lower than contrast group（P<0.05）.Conclusion High expression of the p53 and c-jun gene in vascular may be have some matter with diabetic vascular complications; It can restrain the expression and delay the vascular complications by taken PKC,AR and AGEs inhibition.
［Key words］ transforming growth factor-beta1；p53 gene；c-jun gene; diabetic rat; vascular complications
TGF-β是细胞外基质（ECM）及纤维细胞的有效诱导剂，与糖尿病血管病变有关。在糖尿病大鼠中，多途径联合用药可阻断TGF-β1的产生，从而抑制TGF-β对细胞外基质（ECM）及纤维细胞的有效诱导作用。激活TGF-β是多途径的，其可能途径有：（1）多元醇-蛋白激酶C（PKC）-TGF-β；（2）血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）-PKC-TGF-β；（3）Amadori产物、AGEs-TGF-β；（4）多种生长因子→TGF-β。笔者在研究中发现，糖尿病大鼠有TGF-β1高表达，多途径阻断TGF-β1，对TGF-β1在糖尿病大鼠主动脉血管基质的表达有显著的抑制作用。为了进一步弄清TGF-β1与相关原癌基因的关系，笔者采用RT-PCR探讨多途径阻断TGF-β1对抑癌基因p53、原癌基因c-jun在血管基质表达的影响。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 雄性成年Wistar大鼠60只，体重（195±10）g，由南华大学实验动物部提供。
1.1.2 试剂 链脲左菌素（streptozotocin,STZ）购自Sigma公司；兔抗鼠TGF-β1多克隆抗体购子自Santa Cruy公司；DAB显色剂和免疫组化SABC试剂盒购自博士得公司。逆转录试剂盒购自上海生物工程公司。
1.2 方法
1.2.1 动物分组 将大鼠随机分为糖尿病不用药组（contrast）、糖尿病联合饲养组（combine）及单独用药组3组，共5组，每组10只。采用PKC抑制剂维生素E，AngⅡ受体抑制剂Losartan，AGEs抑制剂氨基胍（AG），联合组用Vitamin E［10 mg/（kg·d）］、Losartan［10 mg/（kg·d）］、AG［50 mg/（kg·d）］，蒸馏水稀释至5 ml，一次性灌胃。单独用药组分别用Vitamin E［10 mg/（kg·d）］，Losartan［10 mg/（kg·d）］，AG［50 mg/（kg·d）］，蒸馏水稀释至5 ml，一次性灌胃；不用药对照组用5ml蒸馏水，共饲养12周。
1.2.2 动物模型制作 用0.1 mol/L，pH 4.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液把STZ配成5%的溶液，按65 mg/kg BW单次腹腔内注射（对照组注射0.25 ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液），48 h后用尾静脉采血测血糖，连续3天，血糖≥16.7 mmol/L者即为糖尿病鼠。
1.2.3 标本收集 治疗结束时，断颈法处死大鼠，10 min内取出整条主动脉，分离血管外组织，PBS清洗血管腔，置于液氮中备用。
1.2.4 血管壁总RNA提取鉴定 从液氮中取出血管，取30 mg，置入研钵中，边研磨边加液氮直至研成粉末，在液氮未挥发前，将粉末转移至Eppendorf管中，然后按试剂盒说明进行提取（上海生物工程公司，超绝总RNA抽提试剂盒）。提取总RNA用紫外线分光光度计鉴别其浓度和纯度，0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定提取质量。-20 ℃保存备用。实验中所用物品均用0.1% DEPC水处理。提取的RNAOD260/280均略大于2.0，0.8%琼脂糖凝胶电泳可见明显的18S和28S的条带（图1），表明提取的总RNA质量和纯度很好，可直接用于RT-PCR。
1.2.5 RT-PCR 先按逆转录试剂盒说明书（上海生物工程公司）将总RNA进行逆转录，再按PCR试剂盒进行扩增（引物由南华大学医学院分子生物学实验中心提供）。反应体系：模板cDNA10 μl，TaqDNA聚合酶1 μl，5×RT缓冲液4 μl，20mM dNTP 2 μl，上游引物0.5 μl，下游引物1 μl，加双蒸水至30 μl。p53基因扩增引物：上游引物5′-ACCATGAGCGCTGCTCAGAT-3′，下游引物5′-AGTTGCAAACCAGACCTCAG-3′，片段长度为216bp；c-jun基因扩增引物：上游引物为5′-ATGACTGCAAAGATGGAAACGACC-3′,下游引物为5′-GATGTGCCCGTTGCTGGACTGGAT-3′，片段长度为264bp；管家基因β-actin扩增引物：上游引物为5′-CGAGCGGGAAATCGTGCGTGACATTAAGGAGA-3′，下游引物为5′-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3′，扩增片段长度为479bp。扩增条件：95 ℃变性10 min，95 ℃ 40 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，30个循环；72 ℃延伸10 min后4 ℃终止反应。将反应产物在0.8%琼脂糖凝胶电泳，观察RT-PCR结果。
1.2.6 扩增产物半定量分析 扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳后，经Pharmacia biotech扫描系统扫描，比较各组信号强度，并以p53 mRNA表达强度和管家基因β-actin的强度的比值来计算mRNA的表达量。
1.3 统计学方法 数据用均数±标准差（x±s）表示，组间差异用t检验。
2 结果
2.1 扩增产物定性分析 RT-PCR产物经2%的琼脂糖电泳后分析，基因的扩增产物和理论长度一致，证明为p53、c-jun，β-actin的扩增片段。干预治疗后标本处理，实验方法同未处理大鼠。
2.2 扩增产物定量分析 各组均有p53基因的表达，除联合组和正常组外，均高于β-actin基因的表达；联合组则低于β-actin的表达，p53和c-jun基因mRNA表达量在维生素E、氯沙坦、氨基胍之间无明显组间差异，而联合组p53 和c-jun mRNA的表达量明显低于其他三组，差异有显著统计学意义（P<0.05，见表1）。 表1 p53、c-jun mRNA表达量注：与联合用药组比较*P<0.05；与其他两组比较，△P＞0.05
3 讨论
2型糖尿病发生大血管病变的危险性较正常人高约3倍，其中50%～75%的患者死于心血管并发症。该危险性的增高不能完全用传统的危险因子如吸烟、高胆固醇血症和高血压及血糖控制来解释。并不是所有的2型糖尿病患者都出现大血管病变，其发生有明显的家族性，提示2型糖尿病大血管病变的发生与遗传关系密切［1］。
癌基因（oncogene）是存在于生物细胞中的一个基本的基因组,既存在于癌肿细胞中,也存在于与癌基因DNA序列同源的正常细胞中,在正常细胞中不表达或是有限制的表达,对细胞无害，当受到化学、物理等因素作用,这部分基因被活化并异常表达,导致细胞发生变化。动脉平滑肌细胞增殖及转化在动脉粥样硬化的形成过程中发挥重要作用。生长因子和癌基因是影响平滑肌细胞增殖的主要因素［2］。
高糖状态下,二酯酰甘油（DAG）合成增加,通过激活PKC继而激活细胞内一些转录因子（c-fos,c-jun）,启动和增强细胞外基质信使核糖核酸的转录水平,使细胞外基质的合成增加;PKC能刺激血管内皮细胞Von Willebrand因子的生成,增加血浆或组织中纤溶酶原活化物抑制剂（PAI-1）的含量和活性,从而促进糖尿病性血管病变的高凝、低纤溶、高血黏度的形成,有利于血栓形成及持续存在。PKC通路的活化亦能引起磷脂酶A2 （PLA2）活性增高,PKC、PLA2通路可引起细胞膜Na+-K+-ATP酶活性降低,直接影响心肌细胞的功能［3］。
我们的实验结果显示,STZ大鼠主动脉中，抑癌基因p53和原癌基因c-jun有明显的表达，与正常组差异有显著性（P<0.05）。通过多途径干预TGF-β1，12周后p53、c-jun基因在实验组中表达明显减弱，与对照组差异有显著性（P<0.05），提示STZ糖尿病大鼠主动脉组织中抑癌基因p53和原癌基因c-jun可能与糖尿病大鼠大血管病变有关，多途径干预TGF-β1可以抑制p53、c-jun基因表达，延缓大血管病变形成。
*基金项目：深圳市南山区科技局资助课题（编号：NS2003009）
【参考文献】
1 孙明晓，郭立新.2型糖尿病大血管病变相关基因的研究进展.国外医学·内科学分册，2003，30（5）：214-217.
2 汪浩川，刘秉文.生长因子、癌基因与动脉平滑肌细胞增殖.生理科学进展,1994，1（1）：48-53.
3 George I,King H.Biochemical and molecular mechanism in the development of diabetic vascular complications.Diabetes,1997,44 （Supp l） : 105-107.
作者单位：518051 广东深圳，深圳市南山医院（△现单位为深圳光明医院）