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【摘要】 目的 探讨第10染色体缺失与张力蛋白同源的磷酸酶基因（PTEN）、微血管密度（MVD）与血管内皮生长因子（VEGF）表达在大肠癌中的变化，以及与大肠癌临床病理的关系。方法 采用免疫组织化学SP方法检测76例大肠癌组织中PTEN、VEGF表达，用CD34染色标记血管内皮细胞，对癌组织中MVD进行计数，分析各指标与大肠癌临床病理学特征的关系。结果 大肠癌组织中PTEN蛋白表达阳性率为44.74%（34/76），显著低于正常大肠黏膜组织的阳性率（P＜0.01）；VEGF阳性表达率为75.00％（57/76），MVD为34±7.8，显著高于正常大肠黏膜组织的阳性率（P＜0.01）；在肿瘤坏死区周围或肿瘤浸润边缘VEGF表达较强，MVD较密集。PTEN蛋白低表达和VEGF蛋白高表达及MVD与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、浆膜浸润、远处转移及TNM分期密切相关（均P＜0.01），而与肿瘤大小、组织病理学类型无关（均P＞0.05）。VEGF阳性表达组MVD显著高于阴性表达组（P＜0.01）。相关分析表明，PTEN和VEGF蛋白表达呈负相关（P＜0.05），MVD与VEGF呈正相关（P＜0.05）。结论 PTEN和VEGF蛋白表达与大肠癌临床病理特征和生物学行为有密切关系，PTEN、VEGF表达和MVD与结直肠癌侵袭转移和预后有关，联合检测PTEN和VEGF蛋白的表达，可用于评估大肠癌侵袭转移能力，对大肠癌的预后判断具有一定的临床意义。
【关键词】 大肠癌;第10染色体缺失与张力蛋白同源的磷酸酶基因；血管内皮生长因子;微血管密度
Clinical signifcance of PTEN，vascular endothelial cell growth factor and microvessel density in colorectal cancer tissue
ZHANG Yi.Jiangbin Hospital of Fuling District,Chongqing 408000,China
［Abstract］ Objective To explore the relationship of the the expression of tumor suppressor gene PTEN，vascular endothelial cell growth factor（VEGF）protein and microvessel density（MVD） with the pathological types and clinical stages of colorectal cancer.Methods The expression of PTEN，VEGF and MVD in 76 patients with colorectal cancer were assayed by using immunohistochemical SP method.The relationship of the PTEN，VEGF and MVD with the pathological TNM types and clinical stages of colorectal cancer was analyzed.Results The total positive rates of PTEN and VEGF protein staining in 76 cases of colorectal adenocarcinoma were 44.74%（34/76）and 75%（57/76）respectively，the microvessel density （MVD） was 34 ±7.8.In the marginal area where the colorectal cancer grew actively,MVD was the highest;the expression of VEGF in the cancerous cell plasm was significantly higher than that in the neighboring noncancer tissues （P＜0.05）.The low level of PTEN protein expression and the high level of VEGF protein expression，and MVD were correlated with the TNM stage,serosa infiltration,lymph node metastasis of colorectal adenocarcinoma （P＜0.05），but not related to tumor size,tissue type（P>0.05）.MVD in positive VEGF group was higher than that in negtive VEGF group.Expressions of PTEN， VEGF and MVD was correlated with clinical pathology and prognosis.Linear correlation analysis showed t he expression of PTEN protein was negatively correlated with that of VEGF protein （P＜0.01），VEGF and MVD had positive correlation（P＜0.05）.Conclusion The expressions of PTEN and VEGF protein were significantly correlated with the clinicopathological characteristics and biologic behaviors in colorectal adenocarcinoma.The combined detection of PTEN and VEGF protein expression may be helpful to evaluate prognosis and infiltrative capability of colorectal adenocarcinoma.
［Key words］ colorectal cancer;phosphatase and tension homolog deleted on chromosome ten gene；vascular endothelial growth factor;microvessel density
肿瘤的发生、发展是多因素、多阶段和多基因改变的过程，其中抑癌基因的突变和原癌基因功能增强是主要的原因之一，实体肿瘤的生长、转移和预后依赖于血管生长。因此，从抑癌基因着手研究阻止或抑制血管生长，对抑制肿瘤的生长和转移具有重要意义。第10染色体缺失与张力蛋白同源的磷酸酶基因（phosphatase and tension homolog deleted on chromosome ten gene,PTEN）是近年发现的新抑癌基因，目前已经证实其与多种肿瘤的发生发展有密切的关系。且其表达异常与肿瘤发生发展的生物学行为有一定相关性。大肠癌是我国常见的多发性的恶性肿瘤之一，在大肠癌组织中通过多种途径表达降低。PTEN的突变和异常表达与大肠癌的发生、发展、浸润、转移显著相关，可能成为检测大肠癌的有效指标之一。肿瘤血管形成与肿瘤的生长、浸润、转移及复发密切相关。血管内皮生长因子（vascular endothelial cell growth factor，VEGF）在肿瘤的血管形成中起重要作用，是一种特异性内皮细胞有丝分裂原，具有促进内皮细胞增殖、诱导新生血管形成的作用，许多肿瘤细胞分泌VEGF，诱导肿瘤血管形成，从而促进肿瘤生长。微血管密度（microvessel density,MVD）是衡量肿瘤血管形成程度的标志，VEGF表达与MVD密切相关。因此，笔者采用免疫组化SP法，随机检测了76例大肠癌病例的手术标本中的肿瘤抑制基因PTEN、VEGF的表达和MVD值，分析PTEN、VEGF表达和MVD与大肠癌临床病理学特征的关系，并分析PTEN和VEGF蛋白表达的关系，旨在探讨PTEN和VEGF蛋白表达在大肠癌发生发展过程中的作用，为大肠癌的诊断及防治提供理论基础。
1 资料与方法
1.1 一般资料 随机取我院外科2004～2006年10月手术治疗的大肠癌患者76例，其中男42例，女34例，平均年龄55岁（37～78岁）。术前所有的患者均进行结肠镜检查和活检，所有病例均经病理证实，患者术前均未进行过任何放疗或化疗。本组病例中根治性大肠癌切除术65例，非根治性手术者11例。其中腺癌60例，黏液癌16例。60例腺癌中高分化腺癌21例，中分化腺癌39例，低分化腺癌16例。有淋巴结转移33例，有远处转移13例。根据病史及病理报告，并根据国际抗癌联盟（UICC）关于大肠癌TNM分期法进行临床分期，结果Ⅰ期10例，Ⅱ期33例，Ⅲ期20例，Ⅳ期13例。另择20例正常大肠黏膜标本作为对照。每份标本石蜡切片2张，取材部分包括肿瘤边缘，切片厚度4 μm。
1.2 主要试剂 第一抗体试剂，即用兔抗人PTEN多克隆抗体、兔抗人多克隆VEGF抗体和鼠抗人单克隆CD34抗体；第二抗体试剂，链霉素抗生素蛋白一过氧化酶（SP）免疫组化染色超敏试验盒均购于福州巴迈新生物技术开发公司。染色剂：二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）购于北京中山生物技术有限公司。
1.3 检测方法及结果判定 PTEN和VEGF的阳性判定：PTEN、VEGF为胞浆着色，染色阳性以胞浆呈棕色颗粒状为标准，且着色明显高于背景或背景不着色，而细胞着色者为阳性细胞染色。每张切片根据阳性细胞染色强度及阳性细胞百分数的多少进行分级：染色强度（不着色、弱、中、强）及阳性细胞百分数（0.1％～25％、26％～50％、51％～75％）分别积分为0、1、2、3。并根据指标的分数之和分为4级，即2项分数之和为0分者，计为VEGF表达为阴性（-），1～2分者为弱阳性（+），3～4分者为阳性（++），5～6分者为强阳性（+++）。
CD34的阳性判定参照以下方法:CD34阳性以血管内皮细胞呈棕色或棕黄色为标准；微血管计数以被染成棕黄色的单个内皮细胞或内皮细胞族作为一个血管计数。只要结构不相连，其分支结构也计作一个血管计数。低倍镜（×40）下观察切片，选择微血管分布最高密度区，然后在高倍镜（×200，以每个视野面积为0.785 mm2）下计数3个视野的微血管数，取其平均值为该例的MVD值。
1.4 统计学方法 MVD以均数±标准差（x±s）表示，PTEN、VEGF的表达以阳性计数百分比表示。VEGF表达和MVD值与组织学分级和TNM分期的比较均采用χ2检验。
2 结果
2.1 PTEN、VEGF和MVD在大肠癌组织、癌旁组织及正常大肠组织中的表达 见图1，2。不同临床和病理特点大肠癌患者PTEN和VEGF蛋白表达情况的比较见表1。表1 PTEN、VEGF和MVD在大肠癌组织中的表达从表1可见，不同年龄和组织类型大肠癌患者PTEN、VEGF蛋白表达阳性率的差异均无统计学意义；而不同Dukes分期、有无浆膜浸润和淋巴结转移的大肠癌患者，其PTEN、VEGF蛋白表达阳性率的差异均有统计学意义。
大肠癌组织中PTEN、VEGF在高倍镜下肿瘤的新生微血管染成棕褐色（图3、图4），切片背景清晰，在肿瘤生长活跃的边缘区，MVD值最高（图5、图6）。而VEGF的表达主要见于血管丰富的肿瘤细胞胞浆内，且在癌细胞内的表达强度高于癌旁组织。从癌周组织到大肠癌组织MVD值逐渐增加，经q检验大肠癌组织MVD值明显高于癌周组织，两者差异有统计学意义（P＜0.05）。说明大肠癌组织中血管生成较癌周组织活跃。VEGF阳性表达率和强阳性表达率从癌周组织到大肠癌组织逐渐增加，且每两组之间差异有统计学意义（P<0.05）。这个结果显示，VEGF在大肠癌组织和癌周组织中有较高阳性表达。
76例大肠癌中PTEN蛋白表达阳性34例（44.74％），20例正常大肠黏膜组织PTEN蛋白表达均为阳性（100％），两者的差异有统计学意义（P＜0.05）。
本组大肠癌组织、癌旁区及正常大肠组织中VEGF的阳性表达率分别为75.00％（57/76）,13.16％（10/76）和5.00％（1/20）。大肠癌组织的VEGF的阳性表达率和MVD明显高于癌旁区和正常组织（P＜0.05）。
2.2 VEGF表达和MVD值与大肠癌临床指标的关系 MVD值与VEGF表达在不同的大肠癌病理分型中各不相同，其差异具有统计学意义（P＜0.05）。76例患者中，按TNM临床分期，Ⅰ+Ⅱ期与Ⅲ+Ⅳ期的VEGF阳性表达率分别为69.76％（30/43）,81.82％（27/33），二者之间有统计学意义（P＜0.05）。提示：随着大肠癌逐渐发展，VEGF表达增强和MVD值增加。
就浸润深度而言，达浆膜层者VEGF阳性表达率为80.00％（28/35），未达浆膜层者VEGF阳性表达率为70.73%（29/41），二者之间差异有统计学意义（P＜0.05）。有淋巴结转移的VEGF阳性表达率为81.82％（27/33），无淋巴结转移的VEGF阳性表达率为69.77%（30/43），二者之间差异有统计学意义（P<0.05）。说明VEGF表达与大肠癌浸润深度及淋巴结转移有密切关系。VEGF的表达与大肠癌分化程度也有关,各组之间差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。表2 PTEN和VEGF表达与大肠癌临床指标的关系
2.3 MVD值与大肠癌临床指标的关系 按TNM分期，Ⅰ期与Ⅱ期、Ⅲ期与Ⅳ期之间差异无统计学意义（P>0.05），而Ⅰ期与Ⅲ期之间，Ⅱ期与Ⅲ期、Ⅳ期之间比较，MVD值的差异有统计学意义（P＜0.05＝。提示临床分期越晚，MVD值越大，血管增生越活跃。见表3。表3 MVD值与大肠癌临床指标的关系就浸润深度而言，达浆膜层者的MVD值（54±3.8），明显高于未达浆膜层者的MVD值（30±4.2），二者差异有统计学意义（P＜0.05）。说明大肠癌的浸润生长与血管形成是同步的。淋巴结转移者的MVD值（53±5.9）明显高于无淋巴结转移者的MVD值（30±2.3），二者差异有统计学意义（P＜0.05）。说明大肠癌的淋巴结转移与其血管形成有密切的关系。
经相关分析表明，MVD与VEGF呈正相关（r=0.624，P<0.05）。
2.4 PTEN和VEGF蛋白表达的关系 VEGF蛋白表达阴性者的PTEN蛋白表达阳性率为100％。VEGF阳性者的PTEN蛋白表达阳性率为29.80％。两者的表达呈负相关（r=-0.50，P<0.01）。经相关分析表明，MVD与VEGF呈正相关（r=0.624，P<0.05）。
2.5 Cox回归分析 对患者的性别、年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、临床分期、肿瘤分级、PTEN与VEGF表达水平、MVD值进行多因素分析，结果表明：临床分期、肿瘤分级、PTEN与VEGF表达和MVD值都是影响大肠癌患者预后的重要因素，见表4。表4 各种临床指标的Cox回归分析
3 讨论
第10染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白基因（phosphatase and tension homolog deleted on chromosome ten gene，PTEN）定位于人染色体10q23.3，是迄今发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因，其编码蛋白与助蛋白及细胞骨架张力蛋白有广泛同源序列，并具有双特异性磷酸酯酶活性。其蛋白产物通过下调Aphosphatidylinositol-3-kinase（PI3K）/protein kinase B （Akt/PKB）通路负性调节细胞迁徙和生存，诱导细胞周期阻滞于G1期。同时，PTEN通过对焦点黏附激酶（FAK）的去磷酸化作用影响整合素介导的聚集黏附过程，抑制肿瘤细胞的浸润和转移。本研究显示，PTEN蛋白在44.74％的大肠癌中呈阳性表达，显著低于正常大肠黏膜组织的阳性率（P<0.05）；PTEN蛋白低表达与大肠癌TNM分期、浆膜浸润、淋巴结转移有关（均P<0.05），表明PTEN蛋白阴性表达的肿瘤更具有侵袭性和转移性。文献报道，PTEN蛋白高表达的大肠癌细胞系，其黏附和迁移能力显著降低，在PTEN缺失的细胞内重新转入PTEN［1］，可抑制细胞的迁移，同时也对细胞的黏附和铺展起到暂时的抑制作用，这种黏附抑制作用可能与PTEN抑制黏着斑形成致使黏着斑数量下降有关。PTEN抑制黏着斑形成可能主要是通过抑制FAK-P130通路及通过改变细胞内PI3，4，5P3的水平来影响黏着斑的结构实现的。
肿瘤的生长和转移依赖肿瘤血管的形成。肿瘤血管生成过程中有许多血管生成因子的参与；VEGF是血管形成因子中最重要的，它是一种糖基化分泌性多肽因子，分子量约4.3，可直接作用于血管内皮细胞，刺激其有丝分裂的发生，从而促进新生血管的生长，也可通过增加血管通透性，使血浆蛋白外渗，为血管内皮细胞的迁移及肿瘤细胞的转移提供基质。血管内皮生长因子通过与其受体的相互作用调控血管的生成，是一种血管内皮细胞特异性的新生因子，在肿瘤血管形成过程中发挥重要作用。研究表明，VEGF在许多良性肿瘤和恶性肿瘤中都有高表达，其表达与MVD关系密切［2～9］。微血管密度被认为是能反映肿瘤血管生成程度的一个指标。CD34是位于血管内皮细胞的抗原决定簇,用抗-CD34抗体标记肿瘤组织内的CD34可以作为肿瘤组织内微血管的标记，并且CD34抗原在对组织冷冻、脱蜡等处理过程中比较稳定。二者与恶性肿瘤癌浸润、生长、转移及预后有不可分的关系。Zhang等［3］研究表明，在肿瘤组织中VEGF高表达，血管增生显著。Terris等［4］对结肠癌的研究发现，VEGF在浸润性结肠癌组织中表达明显升高，微血管密度也明显升高。许多肿瘤的VEGF表达与MVD密切相关，并具有一定的预后价值［5～7］。
本研究通过检测76例大肠癌术后的大肠癌组织及癌旁组织标本中VEGF表达与MVD值，并将其与大肠癌的临床指标一并进行分析。VEGF在大肠癌组织中的表达率为75.00%，大肠癌组织中MVD平均值为34±7.8。说明大肠癌细胞具有分泌VEGF的能力。
在76例患者中，按TNM临床分期，Ⅲ+Ⅳ期VEGF的阳性表达率（81.82%）明显高于Ⅰ+Ⅱ期VEGF阳性表达率（69.76％）（P＜0.05）。随着TNM分期逐渐增加,Ⅰ～Ⅳ期MVD值分别为28±3.5，35±4.5，47±8.6，58±15.5。在Ⅰ、Ⅱ期与Ⅲ、Ⅳ期之间比较有明显相关性（P<0.05）。结果提示：随着大肠癌逐渐发展，VEGF表达逐渐增强，MVD值逐渐增加，肿瘤血管增生越活跃。
本研究结果也显示VEGF表达和MVD值与肿瘤的病理组织学分化程度、浸润深度、淋巴结转移有密切关系（P<0.05）。因此，我们认为VEGF表达、MVD值可作为判断恶性肿瘤生长、浸润、转移的重要指标。这提示针对抗肿瘤新生血管形成及促进因子的治疗策略，可能是恶性肿瘤靶向治疗的又一新途径。大肠癌治疗的一个全新领域是通过抑制VEGF而达到抗肿瘤血管形成的目的［8，9］。在大肠癌患者可将VEGF和其他预后因子结合起来，以判断有较高浸润和转移的病例，对手术后选择放、化疗对象提供指导，并为以VEGF及其受体的作用为靶点治疗大肠癌提供实验依据。
本研究还发现，VEGF蛋白表达阴性的18例大肠癌中PTEN蛋白表达阳性率为100％，而VEGF蛋白表达阳性的62例大肠癌中PTEN蛋白表达阳性率为30.6％，表明PTEN和VEGF蛋白在大肠癌组织中的表达呈负相关（P<0.01），提示在大肠癌的发生发展过程中，PTEN和VEGF具有反向协同作用，共同参与大肠癌的发病机制和演进过程。最近有学者认为：PTEN编码蛋白表达降低或丢失，失去对PI3k／Akt途径的下调作用，增强了缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）对VEGF的诱导。结果，HIF-1α蛋白的过度表达则导致其靶基因VEGF大量表达，后者刺激肿瘤新生血管生成［10，11］。另有研究报道PTEN通过基质金属蛋白酶进而调节肿瘤细胞的迁徙和转移，促进肿瘤细胞向基质浸润，为浸润转移提供前提条件［12］。由此认为：PTEN编码蛋白在大肠癌中的表达下调或缺失，可能通过降低细胞黏附、促进血管形成或提高细胞运动能力等途径参与大肠癌发生发展的过程。联合检测PTEN和VEGF蛋白的表达可作为判断大肠癌侵袭转移能力的一项客观指标，对大肠癌的预后判断具有重要意义。
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作者单位：408000 重庆,重庆市涪陵区江滨医院