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【摘要】 目的 探讨mdm2、Rb基因表达与胃癌发生及胃癌生物学行为的关系。方法 采用免疫组织化学技术（S-P法）检测18例正常胃黏膜、26例异型增生胃黏膜、18例早期胃癌、38例进展期胃癌患者组织中的mdm2、Rb基因蛋白的表达情况，并与临床病理特征相比较。结果 mdm2蛋白在正常胃黏膜、轻度异型增生、中度加重度异型增生胃黏膜、早期胃癌及进展期胃癌组织中的的阳性表达率分别为33.3%、40.0%、43.8%、55.6%、57.9%。Rb蛋白在正常胃黏膜、轻度异型增生、中度加重度异型增生胃黏膜、早期胃癌、进展期胃癌组织中的的阳性表达率分别为94.4%、100%、81.3%、55.6%、63.2%。随着胃黏膜病变的进展，mdm2表达率逐渐增高，在进展期胃癌中达到高峰，但各组间相比，差异无统计学意义。Rb的表达呈相反的趋势，在轻度异型增生中表达最高，到进展期胃癌时表达最低。在轻度异型增生胃黏膜中的表达率与早期胃癌、进展期胃癌相比，差异显著，均有统计学意义（均P＜0.05）。mdm2蛋白表达与胃癌淋巴结转移、浸润深度呈正相关性。Rb蛋白表达与胃癌临床病理学相关指标间未见相关性。mdm2和Rb在胃癌中的表达呈明显负相关性（P＜0.01，r=-0.475）。结论 mdm2、Rb基因蛋白的表达在胃癌的发生、发展过程中起着重要作用，mdm2可作为判断胃癌生物学行为的一个指标，对预后有一定的指导意义；Rb基因缺失发生在胃黏膜癌前病变阶段，监测该基因蛋白的表达对胃癌的早期诊断有一定价值。
【关键词】 胃肿瘤；癌前状态；mdm2基因；Rb基因；免疫组织化学
Expression of mdm2 and Rb protein in gastric carcinoma and precancerous lesion
YANG Hai-xia,Mi Jian-qiang， Xu Ji-ye，et al.Department of Pathology，the First Affiliated Hospital，Henan University of Science and Technology,Luoyang,471003,China
［Abstract］ Objective To investigate the role of mdm2 and Rb gene in gastric mucosal carcinogenesis and the relation between the gene expression and biological behavior of gastric carcinoma.Methods Normal mucusa （n=18）， slight dysplasia（n=10） ,moderate and severe dysplasia （n=16）,early gastric carcinoma（n=18）,advanced gastric carcinoma（n=38） were detected for mdm2 and Rb expressions by immunohistochemistry streptavidin-peroxidase staining（SP method）.Results The positive rates of mdm2 protein were 33.3%,40%，43.8% ，55.6%，57.9% in normal mucosa,slight dysplasia,moderate and severe dysplasia,early gastric carcinoma and advanced cases,respectively.The positive rate of Rb protein were 94.4%,100%，81.3%,55.6%,63.2% in normal mucusa，slight，moderate and severe dysplasia，early gastric carcinoma and advanced cases,respectively.We observed that mdm2 protein expressed with visible crescendo tendency from normal gastric mucosa to dysplasia and carcinoma,while the positive rate of Rb protein decreased gradually with the progression of leisions.The positive rate of Rb protein in slight dysplasias was obviously higher than that of early and advanced gastric carcinom（P＜0.05,respectively）.The expression of mdm2 protein in gastric carcinoma was positive correlated with the depth of invasion and lymph node metastasis（P＜0.05，P＜0.01）.Besides,mdm2 expression is negative correlation with Rb expression in gastric carcinoma（r=-0.475,P＜0.01）.Conclusion There is clinical significance of the expression of mdm2 protein to evaluate the biological behavior of gastric carcinoma.Rb protein can be used as a marker to predict the occurrence of early gastric carcinoma.
［Key words］ gastric carcinoma;precancerous lesions;mdm2 protein;Rb protein;immunohistochemistry
胃癌的发生是一个多阶段、多步骤、逐渐演进的过程。这一过程涉及多种癌基因的激活及抑癌基因的失活。mdm2是一种癌基因，研究显示在多种恶性肿瘤中有此基因的突变、扩增及过度表达［1］。但mdm2在胃黏膜早期癌变，特别是与抑癌基因Rb在胃黏膜癌变过程中的协调作用的研究较少。因此本研究应用免疫组织化学法检测从正常胃黏膜、胃黏膜各级异型增生、早期胃癌及进展期胃癌这一序列变化中mdm2和Rb基因的表达，探讨两者与胃癌发生及胃癌生物学行为的关系。
1 材料与方法
1.1 选择材料 （1）标本：取自河南科技大学第一附属医院2003～2007年胃切除标本100例。其中正常胃黏膜18例，轻度异型增生10例，中至重度异型增生16例，早期胃癌18例，进展期胃癌38例。患者术前均未接受化疗或放疗。所有胃癌病例均经病理证实,并附有完整的临床病理资料。诊断标准参照全国胃癌协作组病理组规定的标准，胃癌组织学类型根据Lauren分型标准，分为两大类：肠型胃癌40例，弥漫性胃癌16例。（2）标本处理：所有标本均经10%中性福尔马林固定,常规石蜡包埋,连续切片,片厚4 μm。载玻片以0.01%多聚赖氨酸（福州迈新生物技术开发公司产品）预处理。（3）试剂：鼠抗人mdm2单克隆抗体、Rb鼠抗人单克隆抗体、免疫组化染色S-P试剂盒及DAB显色剂均购自福州迈新生物技术开发公司。mdm2工作浓度为1∶20，Rb为即用型工作液。
1.2 方法 采用免疫组化S-P法。具体步骤：（1）石蜡切片脱蜡至水；（2）蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min；（3）拟滴加一抗为mdm2基因蛋白的组织切片用pH 6.0枸橼酸缓冲液高压热修复10 min，拟滴加一抗为Rb基因蛋白的组织切片用pH 8.0 EDTA缓冲液高压热修复10 min；（4）修复后的切片在缓冲液中冷却后,滴加过氧化物酶阻断溶液，以消除内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10 min；（5）用5%～10%正常山羊血清封闭，室温孵育10 min；倾去血清，勿洗，滴加一抗，4 ℃冰箱孵育过夜；（6）PBS冲洗，5 min/次，3次；（7）滴加生物素标记的第二抗体，37 ℃孵育10 min；（8）PBS冲洗，5 min/次，3次；（9）甩去PBS，滴加链霉菌抗生物素过氧化物酶溶液，室温下孵育10 min；（10）PBS冲洗，5 min/次，3次；（11）DAB显色；（12）自来水充分冲洗，复染，封片。此外用PBS置换一抗作为空白对照，用试剂盒提供的阳性片作阳性对照。mdm2和Rb蛋白表达阳性的细胞着色为细胞核及部分胞浆内棕黄色颗粒。在光学显微镜下每张切片随机选择5个区域进行细胞计数,每个区域计数100个肿瘤细胞,阳性细胞比例超过10%为阳性表达,小于10%为阴性表达。
1.3 统计学方法 实验所得的数据采用χ2检验和Spearman等级相关性分析,以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 mdm2和Rb基因蛋白在胃癌及胃癌前病变中的表达 mdm2蛋白在正常胃黏膜、轻度异型增生、中度加重度异型增生胃黏膜、早期胃癌及进展期胃癌组织中的阳性表达率分别为33.3%（6/18）、40.0%（4/10）、43.8%（7/16）、55.6%（10/18）及57.9%（22/38）。Rb蛋白在正常胃黏膜、轻度异型增生、中度加重度异型增生胃黏膜、早期胃癌及进展期胃癌组织中的的阳性表达率分别为94.4%（17/18）、100%（10/10）、81.3%（13/16）、55.6%（10/18）、63.2%（24/38）。Rb蛋白在轻度异型增生胃黏膜的表达率与早期胃癌及进展期胃癌相比差异有统计学意义（均P＜0.05），见表1、图1～3。表1 mdm2、Rb蛋白在胃癌及癌前病变中的表达注:轻度异型增生与早期胃癌比较，*P＜0.05；轻度异型增生与进展期胃癌比较，*P＜0.05
2.2 mdm2和Rb蛋白表达与胃癌临床病理特征的关系 mdm2蛋白在浸润深度达浆膜组的表达率明显高于浸润深度达肌层组（P＜0.05），mdm2在淋巴结转移组的阳性率明显高于淋巴结未转移组的阳性率（P＜0.01）。Rb基因蛋白的表达与临床病理特征无相关性，见表2。表2 mdm2、Rb蛋白表达与胃癌临床病理特征的关系注:浸润浆膜层与肌层比较，*P＜0.05 ；无淋巴结转移与有淋巴结转移比较，△P＜0.01
2.3 胃癌中mdm2蛋白表达和Rb蛋白表达的相关性 56例胃癌组织中，mdm2和Rb共同阳性10例，共同阴性5例，表达一致者15例，不一致者41例，mdm2阳性Rb阴性者22例，mdm2阴性Rb阳性者19例。采用spearman等级相关分析，r=-0.475，P＜0.01说明两者表达呈显著负相关性，见表3。表3 胃癌中mdm2蛋白表达和Rb蛋白 表达的相关性注:r=-0.475,P<0.01
3 讨论
mdm2是一种进化保守的基因，基因位于12q13～14染色体区域，编码区1.476kb。其表达产物是一种分子量为90kDa的蛋白质，蛋白质位于细胞核，半衰期很短，是调节p53、Rb通路的重要因子。目前认为mdm2产物可分别与p53、Rb结合而使其功能丧失，从而调节细胞周期，以维持细胞增殖及分化平衡［1,2］。因此，认为mdm2与p53、Rb之间存在着互为作用的负调节机制［3,4］。研究证明，在多种肿瘤组织中存在mdm2基因突变、扩增及异常表达。mdm2过表达有可能通过不同的途径减弱或消除p53及Rb抑制细胞生长的功能，使细胞持续不断地由G1期进入S期，从而引起细胞无限制增殖，最终发生恶变［5,6］。Rb基因是人类发现的第一个抑癌基因，首先在视网膜母细胞瘤中被发现并克隆成功,它与p53基因一起被认为是最重要的两大抑癌基因。Rb基因定位于染色体13q14区，表达蛋白是一种转录因子，位于细胞核内。Rb蛋白是通过磷酸化及去磷酸化方式来调节细胞周期的，并与p16、CDK4/6、CyclinD1等多种因子形成复杂的反馈调节网络，在细胞周期G1/S检查点，决定细胞增殖进程。至今已在视网膜母细胞瘤、食管癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌等多种肿瘤中发现Rb基因的突变及表达缺失，表明Rb基因与肿瘤的发生密切相关［7］。
新近mdm2与Rb形成的负反馈调节通路在肿瘤产生中的作用逐渐受到人们的重视，已发现在一些肿瘤中mdm2过度表达而Rb基因表达下降，呈现明显的负相关性［7,8］。本研究对胃黏膜序列病变检测的结果显示，mdm2在为癌前病变中的表达率随病变的进展逐渐升高，而Rb表达率则随病变的进展呈下降趋势，两者在胃癌中的表达呈明显的负相关性（P＜0.01）。提示在癌前病变阶段mdm2基因在各种致癌因子作用下被激活，过度表达癌基因蛋白，而Rb基因则发生突变而表达缺失，但Rb基因抑制也有可能与过表达的mdm2蛋白与Rb蛋白结合而降解Rb，使其功能下调有关［9］。癌基因mdm2表达上调及抑癌基因Rb下调引起p53抑癌通路及Rb抑癌通路的异常，导致细胞周期调节失控，细胞由G1期顺利而持续地进入S期进行分裂、增殖，对胃黏膜异型增生的形成直至最后胃黏膜恶变可能起到重要作用。统计学发现，Rb基因在早期胃癌中的表达率明显低于轻度异型增生病变，提示Rb基因可作为胃黏膜病变进展的监测指标，应用于胃黏膜高危人群的随访检测，以期提高早期胃癌发现率。
有研究报道，mdm2与肿瘤生物学行为密切相关。Li等认为mdm2的高表达与鼻咽癌的淋巴结转移及患者低生存率有关［10］，Dogan等的结果显示mdm2的表达与卵巢癌的组织分化程度、患者生存期呈负相关性［11］。本研究结果与上述研究有相似之处，显示mdm2在胃癌侵犯深度不同的患者中的阳性表达率差异有统计学意义（浆膜层组高于肌层组，P＜0.01）；淋巴结转移组的阳性率明显高于淋巴结未转移组（P＜0.05）。提示mdm2表达阳性的肿瘤具有更强的浸润及转移能力。测定胃癌组织中mdm2的表达水平可作为预测患者预后的一个有用的指标。
【参考文献】
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11 Dogan E,Saygili U,Tuna B，et al.p53 and mdm2 as prognostic indicators in patients with epithelial ovarian cancer：a multivariate analysis.Gynecol Oncol，2006，100（1）:5-7.
作者单位：471003河南洛阳,河南科技大学第一附属医院病理科