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【关键词】 聚合酶链反应 实验室 科学质量管理
聚合酶链反应（PCR）技术作为现代分子生物学检测的先进手段之一，为多种疾病提供了核酸的诊断依据，但ＰＣＲ技术是一种基因扩增技术，作为一种分子生物学检测手段其灵敏度达到fg级，细微的变异将会带来极大的误差，因此建立ＰＣＲ实验室必须进行严格科学管理。实时PCR实验室质量管理应以《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》、《临床基因扩增检验实验室基本设置标准》、《临床基因扩增检验实验室工作规范》为蓝本，实施实验室的科学质量管理。现就我室现状浅析实时PCR质量管理要素。
1 人员培训
积极参加全国临床基因扩增检验技术的严格培训，努力扎实地学习核酸化学、分子生物学、微生物学的基本理论，掌握临床基因检验技术，派相关人员到上级医院进修学习。
2 实验室的设置
遵守相关法规进行实验室的设置建设。实验室应分为：（1）试剂贮存和准备区；（2）标本制备区；（3）扩增区等严格分隔。每一区域须有专用的仪器设备，有明确的标记，避免各区物品发生混淆。进入各个工作区域必须严格遵循单一方向顺序，即只能从试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区，避免发生交叉污染。在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服，以便于鉴别。当工作者离开工作区时，不得将各区特定的工作服带出，各区清洁消毒也应如此。总的方针是：各区独立，注意风向，因地制宜，方便工作。
3 实验室污染的排除
在实验的操作过程中，必须戴一次性手套、帽子，并经常更换，加样器、吸头等必须经高压处理，避免交叉污染，防止核酸酶的污染。工作结束后必须立即对工作区进行清洁，用10%次氯酸钠擦拭，再用70%乙醇擦拭，再用可移动紫外灯（254 nm波长）调至实验台上60～90 cm内过夜照射，可有效灭活扩增产物。要正确的使用加样器，用带滤芯的吸头，防止气溶胶所致的污染，用过的加样器吸头必须放入专门的消毒容器内，注意防止实验材料外溅，须做好处理并作出记录。PCR反应最大的特点是具有较大的扩增能力与极高的灵敏度，易造成实验室污染，造成错误的结果产生。因此应充分认识到污染的原因，如：（1）标本间交叉污染，为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好反应液的反应管，必须有明确的样品处理和灭活程序；（2）PCR试剂的污染，主要是由于在PCR试剂的配置过程中加样枪、容器、双蒸水及其他溶液被PCR核酸模板污染；（3）PCR扩增产物污染，主要是气溶胶污染，在操作过程中，必须有高度的责任感，熟练掌握基因操作的技巧，基因操作需要实验技巧，是质量保证体系的重要部分。一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染，是什么原因造成的污染，以便于采取措施，防止和消除污染。阳性对照，选择高中低阳性对照物，以便及时更好的反应监测整个实验过程，但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增标本污染的可能性很大，在使用过程中，注意防止污染。阴性对照，每次PCR实验务必做阴性对照。（1）标本对照：被检测的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照。（2）试剂对照：在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染；重复性试验，选择不同区域的引物进行扩增。
4 仪器的校准
仪器性能稳定调试校准好是基因操作的前提条件，离心机温度、转速以及PCR仪的温度校准都直接关系到检验报告的质量。
5 样本的采集
常用于基因扩增检测的临床标本包括EDTA或者是枸橼酸钠抗凝全血或骨髓、血清或血浆、痰、CSF、尿及分泌物等。采血液样本时，应用一次性密闭容器，如真空采血管，非密闭采集样本时，必须注意防止来自采样者的皮屑或分泌物的污染，采样时必须戴一次性手套、帽子。玻璃器皿在使用前应高压处理，可使核酸酶永久性失活。进行抗凝处理，不能使用肝素抗凝，肝素是Taq酶的强抑制剂。样本采集后应及时分离，-20 ℃保存。标本的收集，应在三个区域外收集。
6 质量控制
应在日常常规工作的基础上进行IQC以监测方法或者检测系统的稳定性，通过室内质控系统，使用质控品，确定质控标准，可以评价检验结果的精密度，结合室间质量评价（EQA）可以评价检验结果的准确性。通过有效的质量控制将有利实时PCR的检验报告的科学性和准确性，真正实现为患者服务的宗旨。
(编辑：丁 林)
作者单位：418400 湖南靖州，靖州县人民医院检验科