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【摘要】 目的 研究鞘内注射(i.t.)氟代柠檬酸（FC）和米诺四环素(MC)对背根节慢性压迫模型(CCD)大鼠脊髓背角突触重塑的影响。方法 采用大鼠CCD模型，48只鞘内置管SD大鼠随机分为六组：sham组（假手术组），CCD组，PBS（溶剂磷酸盐缓冲生理盐水）组（0.01 mmol/L PBS 20 μl，i.t.），FC组（1 μmol/L FC 20 μl，i.t.），MC组(5 g/L MC 20 μl，i.t.)，FC+MC组(1 μmol/L FC和5 g/L MC混合液 20 μl，i.t.)。术后每天给药1次，第14天处死，采用免疫组织化学方法和电镜技术观察大鼠脊髓背角突触数目和突触后致密物厚度的变化。结果 鞘内注射氟代柠檬酸和米诺四环素第14天，大鼠脊髓背角P38阳性表达FC+MC组明显抑制（P＜0.01），sham组次之（P＜0.05），余下四组差异无显著性；电子显微镜观察结果显示CCD组、PBS组、FC组、MC组脊髓背角突触结构明显增厚，sham组有增厚不明显（P＜0.05），FC+MC组增厚不明显（P＜0.01）。结论 鞘内给药后，在本实验剂量下，小胶质细胞抑制剂米诺四环素比星形胶质细胞抑制剂氟代柠檬酸更好地抑制了大鼠的慢性疼痛。鞘内同时注射氟代柠檬酸和米诺四环素可抑制大鼠脊髓背角突触结构的增厚。
【关键词】 脊 鞘内注射 胶质细胞抑制剂 米诺四环素 氟代柠檬酸 背根节慢性压迫 突触 大鼠
Effects on intrathecal administration of fluorocitrate or minocycline on synapsis remodeling of spinal cord in CCD rats
ZHANG Xian-hong，SHEN Wen，WANG Ming-de,et al.Department of Anesthesiology，Hunan Tumor Hospital,Changsha 410006,China
［Abstract］ Objective To study the effects of intrathecal injecting(i.t.) two specieses glia cell metabolic inhibitor fluorocitrate(FC) and minocycline(MC) and phosphate buffered saline(PBS) on synapsis remodeling of spinal cord in chronic compression of dorsal root ganglia (CCD) rats.Methods 48 SD rats with intrathecal catheter insertion and checkouted by lidocaine experiment randomly was divided into six groups (n=8) which included sham group,CCD group (received chronic compression of right dorsal root ganglion),PBS group (0.01 mmol/L PBS 20 μl,i.t.),FC group(1 μmol/L fluorocitrate 20 μl,i.t.),MC group(5g/L minocycline 20 μl,i.t.),FC + MC group(the mixture of 1μmol/L fluorocitrate and 5g/L minocycline 20 μl,i.t.).Sacrifice on the 14th day of CCD was done,expression of the P38 was detected in the spinal dorsal horn on the 14th postoperative day rats by immunohistochemistry techniques,at the same time,the synaptic structure remodeling of those rats using electromicroscope methods were observed.Results The expression of P38 showed that FC+MC group obviously suppressed(P＜0.01),sham group was secondary(P＜0.05) and the rest was no visibly difference in the spinal dorsal horn(P>0.05).The trend was that the synaptic structure was thickening in the spinal dorsal horn under the electromicroscope coincident with the expression of P38.Conclusion After intrathecal administration,minocycline of microglia inhibitor can attenuate better the chronic pain of CCD rats rather than fluorocitrate of astrocyte's.Intrathecal injection of fluorocitrate with minocycline can prevent the synaptic structure thickening in the spinal dorsal horn in CCD rats.
［Key words］ spinal cord;intrathecal injection;metabolic inhibitor of neuroglia;minocycline;fluorocitrate;chronic compression of dorsal root ganglion;synapsis remodeling;rats
传统的观点认为神经胶质细胞仅是对神经元起支持和营养作用，而不具有细胞间的信号传递功能。然而随着研究的深入，越来越多的证据证明，脊髓胶质细胞（主要是星形胶质细胞和小胶质细胞）的激活参与神经元结构和功能的重塑，形成有完整功能的突触［1～3］，介导痛觉过敏的产生和痛觉的持续状态［3,4］。本研究在大鼠背根神经节压迫模型（chronic compression of dorsal root ganglion,CCD）上，通过鞘内注射(intrathecal injecting，i.t.)星形胶质细胞代谢抑制剂氟代柠檬酸(fluorocitrate,FC)、小胶质细胞代谢抑制剂米诺四环素(minocycline,MC)，观察大鼠行为学和突触后致密物的厚度改变，了解胶质细胞代谢抑制剂对CCD大鼠脊髓突触重塑的影响。
1 材料和方法
1.1 药品和仪器 米诺四环素 （Sigma公司，美国），氟代柠檬酸（Sigma公司，美国），PE-10导管（上海），微量进样器（上海），Von Frey 纤维丝（Stolting公司，美国），热痛刺激仪BME-410A(中国医学科学院生物工程研究所)，电镜照相系统T-600型（日本国株式会社日立制作所）。
1.2 动物与分组 雄性SD大鼠 48只（徐州医学院实验动物中心提供），体重200～250 g，腹腔注射戊巴比妥40 mg/kg 后，按Yaksh法［5］鞘内置管，置管后无运动障碍且经利多卡因试验证实导管在鞘内，随机分为sham组（假手术组）、 CCD（背根神经节压迫模型）组、PBS（溶剂磷酸盐缓冲生理盐水）组（0.01 mmol/L PBS 20 μl，i.t.）、 FC组（1 μmol/L FC 20 μl，i.t.）、MC组(5 g/L MC 20 μl，i.t.)、FC+MC组(1 μmol/L FC和5 g/L MC混合液20 μl，i.t.)，每组8只。保持动物在室温20 ℃±2 ℃，昼夜节律，自然饮水、进食，每天上午9点鞘内注射。鞘内给药于手术当天进行，各组于CCD术后第14天处死，取腰骶段脊髓膨大处CCD侧背角1 mm×1 mm×1 mm，立即置于2.5%的戊二醛中，4 ℃冰箱保存备用。
1.3 病理性神经痛模型的建立 鞘内置管第5天,参照胡三觉等［6］方法，在戊巴比妥40 mg/kg腹腔注射麻醉SD大鼠后，沿L4～L6 脊椎右侧切皮，分离脊椎右侧肌肉，暴露L4、L5横突和椎间孔，用弯成直角的长3.5 mm,直径0.7 mm的钢丝，以与背部正中线成30°以及与脊椎侧面水平线成10°向头背端插入L4和L5椎间孔，当钢丝碰到背根节或者神经根时同侧后肢抽动，适当调整钢丝的位置，使其形成对L4和L5背根节稳定的压迫，最后分层缝合肌肉和皮肤。假手术组仅暴露L4、L5横突和椎间孔，不插入钢丝。术后每天腹腔注射40万u青霉素1次，连续3天，预防切口感染。剔除手术后肢体瘫痪的动物。
1.4 检测方法
1.4.1 免疫组织化学方法 大鼠在戊巴比妥钠(60 mg/kg)腹腔注射麻醉下行左心室穿刺，生理盐水200 ml快速灌注，继之以预冷的4%的多聚甲醛350 ml先快后慢灌注约30 min。取L3～L5脊髓段1 cm，置于4%多聚甲醛后固定6 h，然后移入20%的蔗糖（4 ℃）过夜。次日，取脊髓做冰冻冠状连续切片，片厚20 μm。SP法免疫组织化学染色，DAB显色:切片用PBS液冲洗后，在3%的过氧化氢处理10 min后，用5%的封闭血清在室温孵育30 min，加入稀释过的小鼠抗P38(Sigma公司，1∶200) 一抗，4 ℃孵育24 h,顺序加入SP试剂盒的生物素化二抗工作液和辣根酶标记链霉卵白素工作液，以上各步骤均用0.01 mmol/L PBS彻底漂洗切片，最后用即用型DAB显色，在显微镜下观察反应程度，再用0.01 mmol/L PBS及时终止反应，显色后的切片裱于涂有明胶的载玻片上，干燥、脱水、透明，中性树胶封片。
1.4.2 电子显微镜技术方法 切片制备：各组大鼠行为学实验后（术后第7天和第14天），大鼠均在腹腔注射戊巴比妥钠（60 mg/kg）深麻醉下迅速开胸暴露心脏，经升主动脉插管，先以100 ml生理盐水冲净血液，随即以预冷的4％多聚甲醛，0.1 mmol/L磷酸缓冲液（PB，pH 7.4）500 ml先快后慢灌注约1 h，取腰骶段脊髓膨大处CCD侧背角1 mm×1 mm×1 mm，立即置于2.5%的戊二醛中4 ℃冰箱保存备用。电镜观察：将所取脊髓组织1 mm×1 mm×1 mm 浸于2.5%的戊二醛磷酸缓冲液（pH 7.2）固定48 h。1%的四氧化锇后固定1 h，丙酮逐级脱水，包埋（包埋剂的配制：环氧树脂 812∶815∶DDSA∶DMP-30=2.5∶2.5∶8∶0.175）。LKB-5超薄切片机切片，厚度为50 nm。醋酸铀染色，日立H-600型电子显微镜照相。
1.5 突触摄片计数 免疫组织化学方法每只动物每个指标随机取脊髓片3张，高倍镜下以Olympus DP11数码相机在背角截取一屏计数。电镜技术在日立H-600型电子显微镜下，借助Motic Images Advanced 3.0 图像分析系统测量突触后膜致密物的厚度。
1.6 统计学方法 所有数据均用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析及SNK法，与基础痛阈比较采用配对t检验，用SPSS 11.5软件进行处理，P＜0.05认为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 鞘内注射氟代柠檬酸和米诺四环素第14天脊髓背角P38的表达 鞘内注射氟代柠檬酸和米诺四环素第14天脊髓背角P38染色的突触数目sham组明显比CCD组、PBS组、FC组和MC组少(P＜0.01)，显著多于FC+MC组 (P＜0.01)。CCD组、PBS组、FC组和MC组四组间差异无显著性（P>0.05）。见图1、图3。
2.2 鞘内注射氟代柠檬酸和米诺四环素CCD大鼠电镜下脊髓背角突触后致密物厚度的变化 鞘内注射米诺四环素和氟代柠檬酸第14天CCD大鼠脊髓背角突触后致密物厚度，CCD组对比sham组和FC+MC组显著增厚(P＜0.01),和PBS组、FC组、MC组比较无统计学差异(P>0.05)。sham组和FC+MC组突触前膜、突触后膜和突触间隙清晰，突触终末有较多清亮的圆形囊泡；CCD组、PBS组、FC组和MC组部分突触突起融合，突触前膜和突触后膜致密物增厚，密度增大，突触间隙模糊不清。见图2、图4。
3 讨论
长期以来，人们认为突触的形成只和神经元有关，但近来越来越多的实验表明，星形胶质细胞在突触重塑过程中发挥着重要作用。
本实验研究应用免疫组织化学方法对鞘内注射氟代柠檬酸和米诺四环素第14天的CCD大鼠观察了P38（突触囊泡素）标记的大鼠脊髓背角突触数目，结果显示单独鞘内注射氟代柠檬酸或者米诺四环素的FC组和MC组与CCD组及PBS组没有显著差异，同时鞘内注射氟代柠檬酸和米诺四环素的FC+MC组突触数目显著减少；同时在电镜下对鞘内注射氟代柠檬酸和米诺四环素第14天的CCD大鼠观察发现CCD组、PBS组、FC组和MC组突触后致密物的厚度明显增厚，部分突触突起融合、密度增大、突触间隙模糊不清。sham组和FC+MC组突触后致密物增厚不明显，突触前膜、突触后膜和突触间隙清晰，突触终末有较多清亮的圆形囊泡。这一结果提示单独鞘内注射胶质细胞抑制剂没有完全抑制胶质细胞的活化和突触的传递；当同时鞘内注射星形胶质细胞和小胶质细胞抑制剂时突触传递发生障碍，突触数目也有明显减少，有可能2种胶质细胞活化被抑制导致突触重塑障碍。在星形胶质细胞或者小胶质细胞单独被抑制时，一方能否代偿另一方在突触重塑中的作用，尚待进一步的研究。
神经元轴突终末、树突和胞体及星形胶质细胞的突起共同构成三重突触结构（tripartite synapses）［7，8］。星形胶质细胞包围着神经末梢，不仅能调节神经元的活动，而且能影响突触的传递，对正常突触的形成和维持突触的稳定有重要作用，星形胶质细胞与神经元之间存在复杂的相互作用。在病理条件下，新生的神经元虽然已具备了形成突触的基本条件，但只有在胶质细胞存在的环境下才能大量形成功能性突触，胶质细胞不仅可以增加成熟突触的数目，还能增加突触的功能。近年来，随着膜片钳及分子生物学技术的应用，人们发现星形胶质细胞表面不仅具有电压依赖的Na+、K+、Ca2+ 通道，而且分布许多神经递质、神经肽、激素和神经营养因子受体，并能合成和分泌多种神经活性物质，在维持神经元内外环境、生存、迁移、免疫调节、信号转导、轴突生长、突触重塑及功能整合等方面具有重要作用［9］。
小胶质细胞在神经元的生理活动中起支持、营养、保护及修复等重要功能，是神经系统不可缺少的成分。激活的小胶质细胞分泌生长因子、吞噬胶质细胞碎片、抵御外来抗原［10,11］；同时释放大量的兴奋性氨基酸、一氧化氮、前列腺素和促炎性细胞因子（TNFα、ＩＮＦγ、IL-6、IL-1），这些物质弥散到附近的神经元突触，提高神经元的兴奋性，扩大疼痛传入的强度和范围［12］。小胶质细胞对神经系统的损伤有营养保护和神经毒性双向作用。Hynds等的研究结果认为在脊髓损伤区移植小胶质细胞及其分泌的因子可促进脊髓损伤后感觉神经纤维的再生。这些结果提示，在中枢神经系统损伤部位增加激活的小胶质细胞的数量有助于增强一些有利于生长的神经营养因子、细胞因子和细胞外基质的分泌，提供一个有益于突触重塑的生理环境。
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作者单位：410013 湖南长沙，湖南省肿瘤医院麻醉科