胶质细胞参与吗啡耐受的形成

【摘要】  目的 观察长期吗啡治疗引起胶质细胞的应答。方法 采用吗啡鞘内注射和氟代柠檬酸鞘内给药，免疫组织化学方法检测星形胶质细胞的特殊标记物GFAP。结果 通过星形胶质细胞的特殊标记物GFAP在免疫组织化学中进行检测，连续9天，每日1次吗啡全身给药（50 mg/kg,i.p.）引起脊髓、后部扣带回皮质和海马的GFAP免疫染色密度的明显增加,而在丘脑没有变化。这种增加主要是星形胶质细胞的肥大而不是增殖或者移行。吗啡鞘内注射（20 μg/2μl，i.t.）和氟代柠檬酸（1 nmol/μl,i.t.）——星形胶质细胞特异可逆性抑制剂，同时鞘内给药，通过行为学测试，吗啡脊髓止痛耐受只是部分而不是明显减弱，脊髓GFAP免疫染色密度增加也是部分被阻滞。结论 目前研究为在体吗啡耐受形成中胶质细胞的作用提供了第一手证据。

【关键词】  氟代柠檬酸 胶质细胞 胶质细胞酸性蛋白 吗啡 大鼠 耐受

    Formation of morphine tolerance with glial cells

    SHI Wen.Hanshou People’s Hospital of Hunan,Hanshou 415900,China

    ［Abstract］  Glial response to chronic morphine treatment was examined by immunohistochemistry of glial fibrillary acidic protein（GFAP）,a specific marker for astroglial cells.Systemic administration of morphine（50 mg/kg,i.p.） once a day for 9 consecutive days led to significant increase in GFAP immunostaining density in the spinal cord,posterior cingulate cortex and hippocampus but not in the thalamus.This increase was attributed primarily to hypertrophy of astroglial cells rather than their proliferation or migration.When chronic morphine（20 μg/2 μl,i.t.） was delivered in combination with fluorocitrate（1 nmol/μl,i.t.）,a specific and reversible inhibitor of glial cells,spinal tolerance to morphine analgesia was partly but significantly attenuated as measured by behavioural test and the increase in spinal GFAP immunostaining was also greatly blocked.The present investigation provides the first evidence for the role of glial cells in the development of morphine tolerance in vivo.

    ［Key words］  fluorocitrate;glial cells;glial fibrillary acidic protein;morphine;rat;tolerance

    吗啡是一种强效镇痛剂。当长期给药时，会形成耐受。虽然很难理解，这种潜在的吗啡耐受机制被认为包含了复杂的神经可塑性变化。研究的焦点主要是神经中枢NMDA受体和NO在阿片耐受的参与［1］，没有提到在这个过程中胶质细胞的作用。我们把胶质细胞作为研究对象是因为该细胞能释放许多介导吗啡耐受的重要物质，包括NO和环氧合酶产物［2］，假定胶质细胞触发细胞内级联的广泛作用引起中枢神经系统的可塑性改变，阿片耐受是这种可塑性的另一实例。胶质细胞参与吗啡耐受可能的研究：（1）和疼痛过程紧密相关的脊髓和后扣带回皮质；（2）参与学习和记忆的海马。目前研究设计：（1）星形胶质细胞的特异性标记物GFAP在耐受形成中是否发生变化？（2）星形胶质细胞特异性代谢抑制剂氟代柠檬酸是否改变吗啡耐受的形成？

    1  材料与方法

    1.1  动物与给药  SD雄性大鼠饲养在单个的塑料笼子内，温度22 ℃，给予充足的食物和水，间隔12 h后给予12 h光照。所有实验遵照卫生部的标准。给予硫酸吗啡［50 mg/（kg·d），i.p.，Sigma,St.Louis,MO］连续9天给药，同时进行行为学测试。在苯巴比妥钠麻醉下置入聚乙烯导管（PE10）到大鼠的腰部脊髓。恢复4天后，鞘内给予吗啡（20 μg/2 μl）连续5天，每天一次诱导脊髓耐受。第6天行吗啡激发试验（5 μg/2 μl）测试吗啡镇痛效应。氟代柠檬酸（Sigma）给予1 nmol/μl（i.t.）一个剂量。药物用10 μl生理盐水稀释。吗啡的阴性对照组用生理盐水和氟代柠檬酸、溶酶。

    1.2  行为学测试  吗啡的镇痛效应由常规的缩足试验进行评估［3］。将来自于灯泡投射的热辐射光线直接照在左后爪趾内侧皮肤。数字计时器自动读取开始热刺激到缩足的间隔时间即缩爪潜伏期（PWL）。用10 s断电避免组织损伤。4 s内做4次测试，以最后3次缩足时间的平均值为测得值。试验对有害热刺激反应敏感。依据下面的公式（1），缩爪潜伏期（PWL）可用最大可能效应百分率（%MPE）来表示。

    （给药后潜伏期-给药前潜伏期）   （10-给药前潜伏期）×100          （1）

    1.3  免疫组织化学  大鼠用生理盐水和4％多聚甲醛灌注，取L4~5脊髓和脑，后固定1 h，30％的蔗糖液中冷冻过夜。冰冻切片，厚度30 μm。用0.3% H2O2内生性过氧化物酶，再用含有5%标准羊血清（NGS）和0.2% Triton X-100的0.01 M PBS液处理，在PBS液中浸泡3次后，滴加小鼠抗GFAP抗体（1∶200,Sigma），在4 ℃孵育60 h。用PBS液冲洗，异硫氰酸荧光素（FITC）（1∶150,Sigma），4 ℃孵育过夜。切片做初步定量化描述随机抽取切片用高分辨率的数码相机在显微镜上拍照，免疫染色用图像分析软件（Sigma Scan,Jandel Scientific Inc,San Rafael,CA）定量。定量测量法指“反应等级”，由在不同群的免疫标记密度的比率来确定。这种比率法补偿了切片间染色的差异。

    1.4  统计学方法  所有数据采用均数±标准差（±s）表示，组内比较采用配对t检验，组间比较采用单因素方差分析，采用SPSS 11.5软件进行处理，P＜0.05认为有统计学意义。

    2  结果

    2.1  全身性吗啡耐受大鼠GFAP免疫反应性  全身吗啡给药［50 mg/（kg·d），i.p.］9天后，在第10天给予15 mg/kg（i.p.）的激发剂量，进行行为学测试镇痛作用消失。这些全身吗啡耐受的大鼠，在脊髓、后扣带回皮质和海马免疫染色明显增加而在丘脑没有增加（图1A~D），这种增加是星形胶质细胞的肥大而不是增生或移行。因与对照组相比较，星形胶质细胞的外形、计数没有明显变化。在高倍镜下，阳性胶质细胞吗啡耐受组比对照组明显增大、增粗（图1E）。GFAP免疫反应的数量变化如图2所示。

    2.2  脊髓耐受氟代柠檬酸作用  GFAP在脊髓的图1  全身性吗啡耐受大鼠GFAP免疫反应性

    图2  GFAP免疫反应的数量变化

    免疫反应，通过5天给予吗啡（20 μg/2 μl，i.t.，Sigma）诱导脊髓耐受。如图3所示，和对照组相比，反复鞘内给予吗啡导致脊髓GFAP免疫染色增加。然而,吗啡和氟代柠檬酸（1 nmol/μl,i.t.）鞘内给药,这种增加会大大减弱。然后,我们通过行为学测试来研究星形胶质细胞活性被氟代柠檬酸抑制时,吗啡耐受的形成是否受到影响。给予1 nmol氟代柠檬酸30 min后，不改变PWL的基线或者体温,在急性吗啡镇痛也没有明显的影响（P>0.1,n=7）。连续5天给予生理盐水、溶酶、吗啡、氟代柠檬酸或者这四种中的两种同时给药，在第6天PWL的基线没有明显变化（P>0.1,n=7）。在第6天作吗啡激发试验（5 μg/2 μl,i.t.）测试吗啡抗伤害效应,如图4所示,反复给予生理盐水和溶酶后,激发剂量吗啡产生缩足反射的％MPE值69.5±9.5。生理盐水和氟代柠檬酸同时给药,这种效应没有明显变化（P>0.4,n=7）。而吗啡（20 μg,i.t.）5天给药后％MPE值降到16.6±13.7,提示吗啡脊髓镇痛耐受（P<0.01,n=7）。在吗啡和氟代柠檬酸（1 nmol,i.t.）组这种耐受被部分抑制,反映到％MPE值为48.8±3.6（对比耐受组和对照组，P<0.05,n=7）。

    3  讨论

    多年来,星形胶质细胞被认为在中枢神经系统只有支持和营养作用。然而,近来证据有力的揭示在突触的作用方面比以前认为的更活跃。星形胶质细胞有非常复杂的信号转导系统,释放许多神经递质,并引起相应的膜电位变化［4］。星形包绕突触,因此是唯一调节突触传递神经元反应的空间结构。许多研究揭示了星形胶质细胞在异常情况，如疾病或者损伤［5］情况下,它的形态和功能有显著的变化。在我们的实验中,我们研究了星形胶质细胞在长期给予吗啡的治疗中的反应。在动物患病或者损伤，GFAP高表达,GFAP是公认的星形胶质细胞标记物,GFAP表达的改变通常表现为星形胶质细胞对疾病的反应。目前的研究揭示了长期吗啡治疗中星形胶质细胞的肥大和GFAP在脊髓、后扣带回皮质、海马表达的增加。鉴于星形胶质细胞和神经元的相互作用,星形胶质细胞的反应有助于神经元-星形胶质细胞发放信号的变化。

    早些年的研究揭示,氟代柠檬酸目前使用的剂量几乎完全可逆地阻滞了星形胶质细胞的代谢［6］。氟代柠檬酸能暂时性中断星形胶质细胞的功能,降低GFAP的免疫反应性,并于24 h后恢复。这些报道也表示注射1 nmol氟代柠檬酸后神经元的功能和形态不受影响。同样的,每日重复给予氟代柠檬酸,对行为学试验的潜伏期基础值不引起明显变化。据报道,这个剂量的FC能减轻炎症物质介导的机械痛敏和热痛敏,提示星形胶质细胞参与了伤害性疼痛的过程［7］，目前的研究,FC逆转了长期吗啡脊髓治疗引起的免疫组织化学和行为学的变化。因此,星形胶质细胞可能参与了吗啡耐受的形成。

    在吗啡/FC组,吗啡效应的部分维持不是FC自身有镇痛作用,也不是FC和吗啡的强烈相互作用。FC单独不影响疼痛的过程,因为单一鞘内注射FC不引起PWL的改变。在这组，FC表现的是吗啡镇痛。因此，FC影响的是吗啡耐受的形成。对照组的研究证实因为体温没有变化，FC与体温下降无关，对PWL基线也没有影响。

    星形胶质细胞参与吗啡耐受的潜在机制不明确。然而，我们认为有两种可能性：第一种可能是吗啡直接作用于星形胶质细胞，触景生情激发了它们的代谢、形态和功能的改变。星形胶质细胞作为阿片肽类重要发育靶点，它是阿片依赖形成的关键性媒介物。有进一步报道，哺乳动物星形胶质细胞上存在选择性阿片肽生物碱U3受体，并且和耐受形成的重要物质NO的释放直接耦联。在长期吗啡治疗期间至少部分调节了神经元可塑性变化。

    再者，星形胶质细胞调节神经可塑性还有间接的途径。它使氨基酸神经递质如GABA和谷氨酸上调，这些递质也是耐受产生的活性成分。星形胶质细胞被认为是NO和环氧合酶产物的重要来源，它们引起中枢神经系统突触传递的长期性改变。这些物质的抑制在缓解吗啡耐受方面也非常有效。反复吗啡治疗可能影响吗啡和神经递质受体，摄取载体和第二信使系统的相互作用，它们都受星形胶质细胞的控制。所以，星形胶质细胞有几种可能的方式参与吗啡耐受。

    另外，长期吗啡治疗后行为和神经可塑性类似于学习的过程。由于FC中断学习和记忆［8］,FC可能通过削弱海马和后扣带回皮质学习过程干预吗啡耐受。提示这些机制不相互排斥，并且星形胶质细胞可能以几种方式调节突触变化。

    总之，通过免疫组织化学和行为学测试，目前研究提示星形胶质细胞可能参与了吗啡耐受的形成。从星形胶质细胞与神经元多重相互作用来看，它在吗啡耐受的作用值得进一步研究。

【参考文献】
  1 Dunbar S,Yaksh TL.Effect of spinal infusion of L-NAME,a nitric oxide synthase inhibitor,on spinal tolerance and dependence induced by chronic intrathecal morphine in the rat.Neurosci Lett，2006,207:33-36.

2 Powell KJ，Hosokawa A，Bell A，et al.Comparative effects of cyclo-oxygenase and nitric oxide synthase inhibition on the development and reversal of spinal opioid tolerance.Br J Pharmacol，2004,127:631-644.

3 Hargreaves K，Dubner R，Brown F，et al.A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia.Pain,2005,32:77-88.

4 Barres BA.New roles for glia.J Neurosci,2002,11:3685-3694.

5 Franke H，Krugel U，Illes P.P2 receptor-mediated proliferative effects on astrocytes in vivo.Glia,2003,28:190-200.

6 Watkins LR，Martin D，Ulrich P，et al.Evidence for the involvement of spinal cord glia in subcutaneous formalin induced hyperalgesia in the rat.Pain,2007,71:225-235.

7 Milligan ED，Mehmert KK，Hinde JL，et al.Thermal hyperalgesia and mechanical allodynia produced by intrathecal administration of the human immunodeficiency virus-1（HIV-1） envelope glycoprotein,gp120.Brain Res,2001,861:105-116.

8 O’Dowd BS，Gibbs ME，Sedman GL，et al.Astroglia implicated in the energizing of intermediate memory processes in neonate chicks.Brain Res,2004,2:93-102.

作者单位：415900 湖南汉寿，汉寿县人民医院