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【摘要】 目的 分析血液制品特定灭活因子的时效动力学曲线，科学性地评价与改进不合理的病毒灭活参数。方法 系统性整理针对水疱性口炎病毒、黄热病毒、脊髓灰质炎病毒、伪狂犬病毒、脑心肌炎病毒、人类免疫缺陷病毒，人血白蛋白采用巴氏消毒法，狂犬病人免疫球蛋白采用低pH常温孵放法，静注人免疫球蛋白、静注人乙肝免疫球蛋白采用低pH/巴氏消毒法；人纤维蛋白原、人凝血因子Ⅷ采用有机溶剂/去污剂与干热法灭活病毒的验证资料，统计3批样品多个取样点的残余病毒滴度均值、标准差与变异系数，制作灭活病毒动力曲线图并进行分析。结果 人血白蛋白巴氏灭活VSV与Sindbis病毒，HRIG低pH灭活VSV和Sindbis病毒，HRIG低pH灭活HIV病毒，IVIG低pH/巴氏灭活HIV病毒，IVIG低pH灭活HIV病毒，HBIG低pH/巴氏灭活VSV、Sindbis与Polio病毒。结论 建议改进病毒灭活验证标准与不合理的灭活参数；采用终产品样品通过合适细胞或方法直接培养目标病毒来有效监测血液制品的病毒安全性。
【关键词】 血液制品；病毒灭活；动力学
Evaluation on viral inactivation factor and kinetics of blood plasma products
WEI Xian-yi,WEI Hong,JIAN Yuan-yong，et al.Sichuan Yuanda Shuyang Medicine Industry Limited Company,Chengdu 610214,China
［Abstract］ Objective For the purpose of scientific evaluation and improvement on unreasonable parameter of viral inactivation,the dynamics curve of time corresponding to effect by given viral inactivation factor treated to blood plasma product were analyzed.Methods Aimed at vesicular stomatitis virus, sindbis virus, human immunodeficiency virus, polioviruses, pseudorabies virus,encephalon-yocarditis virus; validate data of viral inactivated on pasteurization of albumin, human rabies immunoglobulin with pH 4, human immunoglobulin and human hepatitis B immunoglobulin for intravenous injection with pH 4/pasteurization,treatment on human fibrinogen and human coagulation factor Ⅷ with solvent/detergent and vapor heating at 100 ℃30 min were systemic regularized respectively.The mean and standard deviation also coefficient of variation for virus survival titer in different time were stated, dynamics curve of virus inactivation were made and analyzed.Results Human albumin pasteurization inactivated VSV and Sindbis virus,HRIG low pH inactivated VSV and Sindbis virus,HRIG low pH inactivated HIV virus,IVIG low pH/pasteurization inactivated HIV virus,IVIG low pH inactivated HIV virus,HBIG low pH/pasteurization inactivated VSV,Sindbis and Polio virus.Conclusion Suggestion about improvement on unreasonable parameter and standard of virus inactivation is made,cultivate target virus directly from final product by appropriate cell or method to monitoring viral safety of blood plasma product is advanced.
［Key words］ blood plasma product;viral inactivation;kinetics
为了系统性的分析与比较血液制品的病毒灭活方法与效果，科学性的评价与改进不合理的灭活参数，四川远大蜀阳药业有限公司查阅了委托中国药品生物制品检定所与中国人民解放军艾滋病检测实验室对人血白蛋白（检02第731号）、狂犬病人免疫球蛋白（检06第1643号、军第B06005号）、静注人免疫球蛋白（军第B06002号、军第B06003号）、静注人乙肝免疫球蛋白（检06第1521号）、人纤维蛋白原（检04第2720号）与人凝血因子Ⅷ（检04第2721号）等6类血液制品分别采用巴氏（60 ℃±0.5 ℃，10 h）、低pH孵放（pH 4.1±0.3,24 ℃±1 ℃，孵放21 d）、pH 4.9/巴氏、S/D（0.3%TNBP,1.0%Tween-80；25 ℃±1 ℃；6 h）、干热（100 ℃、30 min）5种病毒灭活方法对水疱性口炎病毒、黄热病毒、脊髓灰质炎病毒、伪狂犬病毒、脑心肌炎病毒、人类免疫缺陷病毒6个指示病毒的灭活验证报告。单纯的以样品灭活前后病毒下降数量来比较，虽然可以说明病毒灭活效果，但特定因子灭活病毒效率的科学性评价需要时效动力学曲线来衡量。基于这样的理由，本文根据上述病毒验证报告资料，系统地整理、统计与制作了病毒灭活曲线图并进行分析，现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 人血白蛋白（human albumin）
1.1.1 巴氏灭活病毒条件 60 ℃±0.5 ℃，10 h。
1.1.2 样品参数 连续3批半成品，蛋白含量：20%，pH 7.0；送检批号：20011134、20011135、20011236。
1.1.3 指示病毒、毒液基础滴度 水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus ，VSV,Indiana株），8.25 LgTCID50/ml（半数培养感染剂量，50％ tissue culture infective dose,TCID50）；辛德毕斯病毒（ Sindbis virus，Sindbis），7.56 LgPFU/ml（蚀斑形成单位，plaque forming unit，PFU）。
1.1.4 试验与对照样品 试验样品（巴氏灭活）、对照样品（－70 ℃存放）；按9∶1的比例在样品中加病毒液（27∶3 ml/批）,按1.2 ml/管分装7个取样点、重复2次的检测样品数量。
1.1.5 样品灭活病毒方法与样品取样时间点 留取零时样品后，样品置59.9 ℃~60.3 ℃水浴振摇，在10 h观察时间内分6次在规定的时间点取样。
1.1.6 取样保存 所有样品取样后立即－70 ℃冻存备测。
1.1.7 滴定方法、最低检测限、培养细胞 VSV：96孔细胞病变法、0.5 LgTCID50/0.1 ml、VERO细胞（非洲绿猴肾传代细胞株,african green monkey kidney cell line，VERO）；Sindbis：6孔盘蚀斑法（结晶紫染色）、未标注、BHK-21细胞（幼仓鼠肾细胞，baby hamster kidney,VHK）。
每批样品须至少重复测定2次，对病毒滴定阴性的样品盲传三代。
1.2 狂犬病人免疫球蛋白（human rabies immunoglobulin,HRIG）
1.2.1 低pH孵放灭活病毒条件 pH 3.8~4.4,23 ℃~25 ℃孵放21 d。
1.2.2 样品参数 连续生产的三批半成品（低pH孵放前），蛋白59~61 g/L,pH 4.1，4 ℃存放，送检批号：20050703、20051104、20051205。
1.2.3 指示病毒、毒液基础滴度 VSV 8.38 LgTCID50/ml；Sindbis 7.24 LgPFU/ml；HIV 8.5 LgTCID50/ml（人类免疫缺陷病毒,human immunodeficiency virus, HIV，ⅢB株）。
1.2.4 试验与对照样品 VSV与Sindbis试验样品（pH 4.1）、对照样品（按5.5 ml酸性样品加1 mol/L的NaOH 0.127 ml 的比例调整至pH 7.0）。按9∶1的比例在样品中加病毒液（36∶4 ml/批）,按1.2 ml/管分装5个取样点、重复2次的检测样品数量。
HIV试验样品（样品+毒液）、阳性对照样品（培养液+毒液）、阴性对照样品（样品+培养液）。按9∶1的比例在样品（培养液）中加病毒液（培养液）（0.9∶0.1 ml/批）,按0.1 ml/次分别在5个取样点取样。
1.2.5 样品灭活病毒方法与样品取样时间点 留取零时样品后，样品置23 ℃~25 ℃孵放21 d，在观察时间内分4次在规定的时间点取样。
1.2.6 取样的pH调整与保存 所有样品取样后立即调整pH至中性，－70 ℃冻存备测。
1.2.7 滴定方法、最低检测限、培养细胞 参见1.1.7项，HIV验证20050703重复检测3次，MT4细胞，最低检测限为2.0 LgTCID50/ml。
1.3 静注人免疫球蛋白（human immunoglobulin for intravenous injection,IVIG）
1.3.1 低pH/巴氏灭活HIV病毒 病毒灭活方法参见1.1.1项, 试验与对照样品参见1.2.4项。
1.3.2 低pH孵放灭活HIV病毒 病毒灭活方法参见1.2.1项。毒液滴度8.5 LgTCID50/ml。
1.3.3 样品参数 蛋白含量5%，pH 4.1±0.3,送检批号：2005122107、2005122108、2005122109。
1.4 静注人乙肝免疫球蛋白 （human hepatitis B immunoglobulin for intravenous injection,HBIG）
1.4.1 低pH/巴氏灭活VSV、Sindbis与Polio-1病毒 病毒灭活方法参见1.1.1项。
1.4.2 指示病毒、毒液基础滴度 VSV8.38 LgTCID50/ml；Polio-1（脊髓灰质炎病毒,polioviruses TypeⅠ，Polio-1）9.25 LgTCID50/ml（最低检测限0.5 LgTCID50/0.1 ml）；Sindbis 7.24 LgPFU/ml。
1.4.3 样品参数 pH 4.9,蛋白质含量50 g/L,送检批号：20050602、20050603、20050604。
1.5 人纤维蛋白原（human fibrinogen）
1.5.1 有机溶剂/去污剂(Solvent/Detergent,S/D） S/D灭活病毒方法 0.3%TNBP,1.0%Tween-80；25 ℃±1 ℃；6 h。（1）样品参数：纤维蛋白原（S/D法前取样、-20 ℃保存），蛋白含量18 g/L、pH 7.0、TNBP 0.3%、Tween-80 1.0%，送检批号：20031020、20031021、20031022。（2）指示病毒、毒液基础滴度：PRV（伪狂犬病毒,pseudorabies virus，PRV）8.88 LgTCID50/ml；Sindbis 7.64 LgPFU/ml。（3）试验与对照样品：按试验样品（S/D+病毒）、对照样品（病毒）、终止对照样品（S/D+稀释液）的设置与比例分别加S/D至0.3%与1.0%、病毒液或稀释液（9∶1），每批样品的终体积为10 ml。（4）样品灭活病毒方法与样品取样时间点：留取1.2 ml零时样品后，样品置25 ℃±1 ℃水浴振摇，在6 h观察时间内分6次在规定的时间点取样（终止对照仅取6 h样品）。（5）取样的稀释、过滤、分装与保存：所有样品取样1.2 ml,立即用含4%小牛血清的细胞培养液以1∶100稀释,过滤除菌，分装，－70 ℃冻存备测。每批样品须至少重复测定2次。（6）滴定方法、最低检测限、培养细胞：VSV：96孔细胞病变法、0.5 LgTCID50/0.1 ml、VERO细胞；Sindbis：6孔盘蚀斑法（结晶紫染色）、未标注、BHK-21细胞。
1.5.2 干热灭活病毒方法 100 ℃、30 min。恒温水浴加热。（1）样品参数：纤维蛋白原中间品（20 ml/瓶、-20 ℃保存），蛋白含量18 g/L、pH 7.0、送检批号：20031020、20031021、20031022。每批24瓶样品试验前25 ℃水浴融化，按9∶1加病毒液后分装（20 ml/瓶），每批样品的终体积为200 ml，－70 ℃冻存，冻干。（2）指示病毒、毒液基础滴度：PRV 8.62 LgTCID50/ml；Sindbis 7.43 LgPFU/ml；EMCV 7.38 LgTCID50/ml（脑心肌炎病毒，encephalon-yocarditis virus,EMCV）。（3）试验与对照样品：试验样品（冻干后加热）、对照样品（冻干前、后不加热）。（4）样品灭活病毒温度与样品取样时间点：留取冻干前、后样品后，样品置98.8 ℃~102.2 ℃水浴恒温加热，在30 min观察时间内分3次在规定的时间点取样。（5）取样的保存：所有样品取样后－70 ℃冻存备测。每批样品须至少重复测定2次。（6）滴定方法、最低检测限、培养细胞：PRV：96孔细胞病变法、0.5 LgTCID50/0.1ml、PK-15细胞（猪肾细胞,pocine kidney cells,PK-15）；Sindbis：6孔盘蚀斑法（结晶紫染色）、未标注、BHK-21细胞；EMCV:96孔细胞病变法、未标注、VERO细胞。
1.6 人凝血因子Ⅷ（human coagulation factor Ⅷ）
1.6.1 S/D灭活病毒方法 病毒灭活方法参见1.5.1项。样品参数：凝血因子Ⅷ（S/D法前取样、-20 ℃保存），蛋白含量16 g/L、pH 7.0、TNBP 0.3%、Tween-80 1.0%，送检批号：20031001、20031002、20031003。指示病毒、毒液基础滴度：PRV 9.12 LgTCID50/ml；Sindbis 7.34 LgPFU/ml。
1.6.2 干热灭活病毒方法 病毒灭活方法参见1.5.2项。样品参数：凝血因子Ⅷ（10 ml/瓶，冻干品），蛋白含量16 g/L、pH 7.0、TNBP 0.3%、Tween-80 1.0%，送检批号：20031001、20031002、20031003。指示病毒、毒液基础滴度：PRV 8.26 LgTCID50/ml；Sindbis 7.28 LgPFU/ml；EMCV 7.38 LgTCID50/ml。
1.7 病毒滴度计算方法 按Karber法计算［1］。
1.8 数据统计与灭活病毒动力曲线图 使用Casio计算器统计以上3批样品7个取样点的残余病毒滴度均值、标准差与各取样时间点合并的变异系数（coefficient of variation,CV），采用电脑Office程序、Excel 2003图表软件制作灭活病毒动力曲线图，3批间病毒残余数量变异系数≤5%时,距病毒滴定阴性时限终端≥2个安全系数设置病毒灭活工艺时限（technical time limit of virus inactivation,TTI）。
2 结果
2.1 人血白蛋白巴氏灭活VSV与Sindbis病毒 见图1。图1 白蛋白巴氏灭活病毒动力曲线
从图1可看出，在1 h内，白蛋白残存VSV与Sindbis病毒很快降低至最低检测限，CV分别是2.9%、2%，TTI分别是1 h、2 h,灭活病毒的数量≥6 Log,说明该方法灭活病毒效果佳。
2.2 HRIG低pH灭活VSV与Sindbis病毒 见图2。从图2可看出，在21 d内，在pH 7.0时，HRIG残存VSV下降1.66 Log（6.2~4.54）, 在pH 4.0时，HRIG残存VSV与Sindbis病毒缓慢降低至最低检测限，灭活病毒的数量≥6 Log, CV分别是3.27%、3%，TTI分别是14 d、28 d,说明该方法灭活病毒效果较好。
2.3 HRIG低pH灭活HIV病毒 见图3。图3 HRIG低pH灭活HIV动力曲线
从图3可看出，在21 d内，在pH 7.0时,HRIG残存HIV下降3.94 Log（8.33~4.39）, 在pH 4.0时HRIG残存HIV缓慢降低至最低检测限，灭活病毒的数量≥6 Log,CV是3.8%，TTI是14 d,说明就HRIG而言， pH 4.0与pH 7.0对HIV的存活时间虽然存在差异但意义不大，HIV对特定环境抵抗力很差。
2.4 IVIG低pH/巴氏灭活HIV病毒 见图4。
图4 IVIG低pH/巴氏灭活HIV动力曲线
从图4可看出，在4 h内，IVIG残存HIV病毒降低至最低检测限，灭活病毒的数量≥6 Log, CV是0，TTI是8 h,说明该方法灭活病毒效果很好。与-70 ℃对照样品比较HIV对热因子非常敏感。
2.5 IVIG低pH灭活HIV病毒 见图5。
图5 IVIG低pH灭活HIV动力曲张（d）
从图5看出，在21 d内，在pH 7.0时IVIG残存HIV下降3.94 Log（8.33~4.39）, 在pH 4.0时IVIG残存HIV缓慢降低至最低检测限，灭活病毒的数量≥6 Log。CV分别是3.7%、3.1%，TTI分别是14 d、28 d,说明就IVIG而言， pH 4.0与pH 7.0对HIV的存活时间虽然存在差异，但意义不大，HIV对特定环境抵抗力很差。
2.6 HBIG低pH/巴氏灭活VSV、Sindbis与Polio病毒 见图6。
图6 HBIG低pH/巴氏灭活病毒动力曲线
从图6可看出，在0.5 h内，HBIG残存VSV、Sindbis与Polio病毒降低至最低检测限，灭活病毒的数量≥6 Log, CV分别是4.3%、3.6%与3.6%，TTI分别是0.5 h、1 h与1 h,说明该方法灭活病毒效果很好（与图1与图4的结果相似）。
2.7 纤维蛋白原S/D灭活PRV、Sindbis病毒 见图7。
图7 纤维蛋白原S/D灭活病毒动力曲张
从图7可看出，在60 min内，纤维蛋白原残存PRV与Sindbis病毒很快降低至最低检测限，灭活病毒的数量≥6 Log, CV分别是2.4%、1.1%，TTI分别是30 min、120 min,相对于未加S/D的PRV对照说明该方法灭活病毒效果很好。Sindbis对S/D因子的抵抗力强于PRV的抵抗力。
2.8 纤维蛋白原干热灭活PRV、Sindbis、EMCV病毒 见图8。
从图8看出，在30 min内，纤维蛋白原残存Sindbis、PRV与EMCV病毒均有显著的下降，灭活病毒的数量分别是5.1 Log、3.67 Log与4.75 Log,CV分别是1.8%、6.3%与3.3%，说明该方法灭活
图8 纤维蛋白原干热灭活病毒动力曲线
病毒效果有效。相对于液体制品，冻干制品的指示病毒对干热因子的抵抗力较强，特别是PRV病毒。
2.9 凝血因子ⅧS/D灭活PRV、Sindbis病毒 见图9。
图9 凝血因子Ⅷ S/D灭活病毒动力曲张
从图9可看出，在60 min内，凝血因子Ⅷ残存PRV与Sindbis病毒很快降低至最低检测限，灭活病毒的数量≥6 Log, CV分别是3.6%、2.1%，TTI分别是30、120 min,相对于未加S/D的Sindbis对照说明该方法灭活病毒效果很好。Sindbis对S/D因子的抵抗力强于PRV的抵抗力（与图7的结果非常相似，使用Sindbis对照）。
2.10 凝血因子Ⅷ干热灭活PRV、Sindbis、EMCV病毒 见图10。
从图10可看出，在30 min内，凝血因子Ⅷ残存Sindbis、PRV与EMCV病毒均有显著的下降，灭活病毒的数量分别是6.31 Log、3.13 Log与5.21 Log, CV分别是1.3%、3.2%与1.7%，说明该方法灭活病毒效果有效（与图8的结果非常相似）。
图10 凝血因子Ⅷ干热灭活病毒动力曲线
3 讨论
分析血液制品特定因子的灭活时效动力学曲线的目的在于科学性的评价与改进不合理的灭活参数。血液制品与病毒从生物学本质上说都是具生物活性的蛋白质。灭活因子是双刃剑，灭活病毒的同时也会损伤制品的生物学活性，HBIG经低pH+巴氏灭活病毒时效价损失可达25%，所以血液制品病毒灭活方法的选择应该权衡利弊。
人血白蛋白经巴氏法可有效地灭活VSV、Sindbis病毒（图1）；HRIG经低pH孵放可有效地灭活VSV、Sindbis与HIV病毒（图2、3）；IVIG、HBIG经低pH+巴氏可有效灭活VSV、Sindbis、Polio与HIV病毒（图4、6）。
低pH+巴氏灭活病毒的速率显著优于单纯的巴氏法（图1、6）；巴氏法灭活病毒的速率显著优于低pH孵放法（图1、2）；HRIG与IVIG生产工艺、临床使用途径不同，但低pH孵放灭活HIV的动力曲线基本相同（图3、5）。
纤维蛋白原与凝血因子Ⅷ经S/D法可有效的灭活PRV与Sindbis病毒，灭活病毒的动力曲线基本相同（图7、9）；纤维蛋白原与凝血因子Ⅷ经干热法可大部灭活PRV、Sindbis与EMCV病毒，灭活病毒的动力曲线基本相同（图8、10）。S/D法灭活病毒的速率显著优于干热法。
热因子可灭活脂包膜与非脂包膜病毒，S/D因子对脂包膜病毒、pH因子对非脂包膜有效。HIV、HBV（乙型肝炎病毒,hepatitis B virus）与HCV（丙型肝炎病毒,hepatitis C virus ）属脂包膜病毒，HAV（甲型肝炎病毒,hepatitis A virus）与人细小病毒B19（human parvovirus B19）属非脂包膜病毒，所以应分别选用脂包膜与非脂包膜病毒灭活方法。虽然巴氏法可同时灭活脂包膜与非脂包膜病毒，在此基础上增加其他的病毒灭活步骤可通过作用互补加强血液制品的病毒安全性，如HBV对热相对稳定（指示病毒PRV）。
分析以上资料认为：相对于低pH与S/D法［2］，巴氏法是液体剂型血液制品病毒灭活方法中最理想的方法，制品pH值与血液内环境的pH值相近似时对蛋白结构与功能活性的保持有好处；S/D是外加化学成分，S/D去除后的残留对人体的健康可能是不利的。根据本文病毒灭活动力学分析，目前的巴氏法采用10 h的持续加热显然时限过长，即病毒彻底灭活的时间远远低于工艺要求时间，3批制品病毒灭活不同时间点的残余病毒数量CV范围≤5%，采用pH 7.0时4 h、pH 4.0时2 h就会完全满足病毒灭活验证指导原则的要求。
采用的方法必须对特定病毒彻底的灭活或去除才能称为有效，因为临床上血液传播疾病的发生与制品是否存在活的病毒而绝对相关，与制品存在活病毒数量的多少相对相关。基于这个观点，本文不赞成采用膜过滤法来去除血液制品病毒。冻干纤维蛋白原与凝血因子Ⅷ干热灭活病毒的速率不理想，在时限终端仍有残余病毒存在［3］，制品显然潜在病毒安全性的风险，采用S/D灭活后凝血因子制品传播甲肝的报道证实了这个问题［4，5］。以灭活病毒数量≥4 Log来判断病毒灭活方法有效的标准是否合理值得商榷，因为在时限终端仍残余病毒与已经被灭活的病毒比较可能存在质的区别。所以，建议其标准是：施加灭活因子的试验样品与未施加灭活因子对照样品比较，灭活病毒的数量统计学差异存在高度显著性；3批间病毒残余数量的CV≤5%时，设置工艺规定的时限终端距病毒滴定阴性时限终端应至少≥2个安全系数；病毒灭活终端样品不得检出残余病毒，盲传三代细胞不得出现特异病变。
目前已知血液制品传播的病毒主要有HBV、 HCV、HIV-Ⅰ、HIV-Ⅱ、人类嗜T淋巴细胞病毒（human T-cell lymphotropic virus,HTLV） ［6］和B19［7］。HTLV感染与输入血细胞关系密切，B19对患有镰刀状细胞贫血患者有严重威胁［1］。本文的结果揭示：液体剂型血液制品的内环境中即使存在HIV也难以存活超过14 d（图3、5），这符合HIV主要通过新鲜血液与冻干凝血因子类产品传播的经验。
由于HIV病毒的安全性［8］与HAV培养困难，HBV与HCV有无法在体外培养的难题［9］，血液制品病毒灭活根据上述病毒脂包膜的有无采用生物相近指示病毒来替代进行工艺灭活验证［10］，而不是像细菌那样通过对终产品微生物培养来直接进行病原学检测。核酸扩增技术（如PCR）只能鉴定病毒数量，无法区别病毒的活性。所以目前血液制品病毒灭活效果的评价依赖的是间接证据。欲有效的监测血液制品的病毒安全性，建议在冻干凝血因子类产品质量标准上，规定批签发产品由签发部门直接使用血液制品终产品进行HIV培养；此外，应探索筛选或改造合适的细胞系直接使用血液制品终产品来培养HBV、HCV病毒。
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作者单位：四川成都，四川远大蜀阳药业有限公司 四川成都，四川大学华西医院