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【摘要】 目的 探讨PCR-STR技术在双生子卵型鉴定中的可行性和有效性并比较该技术与传统鉴定方法的优劣。方法 检测15个短串联重复序列基因座，包括D3S1358、TH01、D21S11、D18S51、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、vWA、D8S1179、TPOX、FGA等13个CODIS基因座以及Penta E、Penta D基因座，比较双生子各基因座基因型，分析双生子卵型，计算双生子累计父权指数。结果 6对双生子获得了卵型鉴定结果，其中4对为异卵双生、2对同卵双生，6对中有2对的鉴定结果与传统判定方法判定结果相左。结论 PCR-STR技术不仅广泛应用于个体识别、亲子鉴定，该技术也可应用到双生子的卵型鉴定，与传统的卵型鉴定方法相比，该方法准确性更高。双生子的遗传流行病学研究中应推荐使用该方法完成卵型鉴定。
【关键词】 STR；双生子；卵型鉴定
Use of PCR-STR technique in zygosity diagnosis of twins
WANG Lin，WANG Yi，MA Xu.Peking Union Medical College，Beijing 100081，China
［Abstract］ Objective To explore whether PCR-STR technique is must or not in zygosity diagnosis of twins.Methods 15 STR were genotyped in five twin’s family.The 15 STR were D3S1358，TH01，D21S11，D18S51，D5S818，D13S317，D7S820，D16S539，CSF1PO，VWA，D8S1179，TPOX，FGA，Penta E and Penta D.Record the genotype result and calculate the combined paternity index (CPI).Results The PI of five twin’s family were all above 10 000，which is the threshold of paternity tesing.There are 4 DZ，and 2 MZ.Two of them were disputed with traditional method.Conclusion PCR-STR technique not noly can be used in paternity testing，but also in zygosity diagnosis of twins.Compared with traditional methods，PCR-STR has the most accurate result.We recommend that PCR-STR should be used in twins study.
［Key words］ STR；twins；zygosity diagnosis of twins
双生子分同卵双生和异卵双生两种。同卵双生（monozygotic twin，MZ）是受精卵在第一次卵裂后，每个子细胞各发育成一个胚胎，故它们的性别相同，遗传特性及表型特征也基本相同，由于同卵双生有完全相同的先天遗传背景，所以在对同卵双生子的研究中，可排除遗传因素的影响，从而有利于对各种疾病与证候的研究。异卵双生（dizygotic twin，DZ），来源于两个卵子分别与精子受精而发育成的两个胚胎，故其性别不一定相同，异卵双生子具有相同的遗传基因型的概率（只有25%或更少），遗传特征及表型仅有某些相似。由于一般双生子具有相同的生长环境，所以在对异卵双生子的研究中，可排除环境的影响。双生子研究有利于在同一个平台上了解遗传因素和环境因素在一种性状与证候中占多大比例，对双生子的研究具有重要的理论价值和现实意义。
根据双生子的性别、胎膜和胎盘关系可初步鉴别双生子的类型［1］，但上述指标尚不够精确，如双生子的性别不同，可确定是异卵双生；双生子性别相同时，如果胎膜和胎盘是独立的两套，可能是异卵双生，也可能是同卵双生。当用上述指标不能精确鉴别时，需要进一步求助其他客观指标或标记如指纹、智力、皮纹等11项指标，该方法是目前快捷、方便、常用的方法。与皮纹、血型等遗传表型标记相比，遗传物质DNA多态标记具有更多的优越性。近年来，有条件的实验室已经不再使用遗传表型标记来进行个体识别。因此本文将目前常规的个体识别技术应用到双生子的卵型鉴定，比较该技术与传统技术的技术可及性和有效性。
1 对象与方法
1.1 研究对象 2004年3月至2008年7月来本实验室参加亲子鉴定的双亲家庭双生子2对，单亲家庭双生子4对，均自愿参加鉴定，双生子年龄3个月~20岁。检材为外周静脉抗凝血1 ml或口腔拭子。
1.2 方法 常规提取Chelex-100法提取DNA。短串联重复序列（short tandem repeat，STR）试剂盒扩增15个基因座，包括D3S1358、TH01、D21S11、D18S51、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、VWA、D8S1179、TPOX、FGA等13个CODIS基因座以及Penta E、Penta D基因座，扩增在ABI 2400热循环仪（Applied Biosystems，美国）上进行。采用ABI Prism 310遗传分析仪（Applied Biosystems，美国）进行自动激光荧光毛细管电泳检测分型。毛细管检测长度47 cm，POP-4胶。使用GeneMapper软件确定扩增片段长度和样本的基因分型。
2 结果
2.1 卵型鉴定结果 见表1。6对双生子中同卵双生2对，异卵双生4对。其中D-02在D18S51基因座出现与其父不符合基因型，其父为21/21，D-02为15/20，经追加D18S1364等9个基因座后确定为STR突变。表1 6对双生子基本情况和卵型鉴定结果汇总
2.2 CPI计算 3对双生子家庭的父亲、母亲，3对双生子家庭的父亲均自愿参加了鉴定，亲权指数的计算公式参照文献［1］。所有家庭累计亲权指数均大于10 000，不可以排除亲缘关系。
3 讨论
3.1 双生子研究是遗传流行病学的重要研究方法 双生子研究是遗传流行病学的天然的良好研究模型。早在1875，英国学者F·高尔顿年就提出通过比较双生子之间的异、同研究遗传和环境对个体表型的相对效应。遗传流行病学（genetic epidemiology）是一门近20多年来发展起来的新兴学科。它借助于群体遗传学的基本理论，分子遗传学的实验手段，流行病学的群体资料收集和处理、病因研究及科研研究设计方法学、生物统计学与电子计算机的数理模型和数值处理方法来研究和阐明与遗传有关的疾病，特别是慢性病中的遗传因素、环境因素和这两种因素的相互作用。此外，遗传可以是生物性状遗传，也可以是文化教养的遗传。由于双生子的特殊遗传背景和教养背景，即同卵双生具有相同的遗传背景和相近的生长环境；异卵双生子具有相近的遗传背景和相同的生长环境。因此，有关双生子的研究逐渐成为近期群体遗传和医学遗传的重点内容之一。
3.2 双生子卵型鉴定方法 如前所述，开展双生子研究的前提是区分双生子的卵型。双生子的卵型鉴定的方法有以下几种方法［2］。
3.2.1 移植法 即根据双生子间对于相互移植组织的相容性的鉴别方法。常用的移植组织是皮肤，如果供体和受体的基因型不同，则移植的皮肤将因组织不相容性而被排斥，因而说明该双生子为异卵双生子。相反的为单卵双生子由于基因型完全相同，表达基本相同的组织抗原，因而移植物不发生排斥现象。该法的结果比较可靠，但皮肤移植实验有一定创伤性，临床可接受性较差。
3.2.2 胎膜法 即根据双生子的胎膜结构进行鉴别的方法。先判别双生子的性别，如果双生子的性别不同，可确定是异卵双生；双生子性别相同时，如果胎膜和胎盘是独立的两套，可能是异卵双生，也可能是异卵双生。异卵双生子一般具有两个胎盘，少数具有联合胎盘，联合胎盘的胎膜膈由两层绒毛膜和两层羊膜组成；单卵双生子只有单个胎盘，胎膜膈仅由两层羊膜组成，少数可以无羊膜膈。该鉴定方法的有一定误差，且必须在分娩当时才能鉴别，在使用上有一定的局限性。本文研究中的第一例A-03/A-04个体在母亲妊娠时B超显示一个胎盘，医生和孕妇本人均认为是同卵双生妊娠，孩子在出生后在肤色等表型方面显示差异。亲子鉴定和卵型鉴定的结果最终显示A-03和A-04均是母亲的亲生后代且为异卵双生子。妊娠时所观察到的一个胎盘可能是由两层绒毛膜和两层羊膜组成的联合胎盘。
3.2.3 相似法 即应用终身不变而又相互独立的人类学指标，在双生子间进行相似性的比较的鉴别方法。早年应用的指标有皮肤纹理、发色、虹膜颜色、齿形等一般体表特征，20世纪的80年代，广泛地采用多种免疫学指标，如红细胞血型系统ABO，P，MN，Rh，Xg等抗原、ABH分泌类型及HLA抗原等，因而又称为血型相似法。随着分子遗传学原理和实验技术的研究进展，本文所述鉴别方法是采用PCR-STR基因扫描技术检测人体终身不变的DNA短串联重复序列的数目，并依照重复数目的多少进行双生子相似性的研究，是相似法一个新的分支。本鉴定方法所用生物学检材微量、取材方便无创伤、结果准确可靠，是目前较为理想的方法。
3.3 国内双生子卵型鉴定中存在的可能问题 (1)国内大多数研究采用胎膜法和双生子一般体表特征完成双生子卵型鉴定，少量文献采用PCR-STR基因扫描法［3，4］。本文仅对6对双生子进行卵型鉴定传统方法和基因扫描法的对比性研究，发现2对结果不一致。造成鉴定结果偏差是因为传统方法所采用的客观指标如皮纹、发色、五官特征，甚至血型等指标是人体的表现型。对于双生子间的个体识别，利用遗传表型标记作为分析判断的工具的局限性更加明显，所有遗传表型标记都是蛋白质类物质，其化学结构很容易在外界因素的作用下遭到破化或失去活性，难以长期保存。对于微量检材中的表型物质，目前的实验技术水平也难于确定它的存在。此外，在人群中，个体间具有相似表型的机会也很高，很多情况下靠表型的检测无法将2个个体区分开来。因此，本文推荐在双生子研究的第一步应当采用基因扫描的方法完成双生子的卵型鉴定工作，以避免研究方法的系统误差。(2)虽然国内外学者首肯PCR-STR基因扫描法是技术金标准［5］，但是对于STR基因座选择个数和扫描方法的问题还没有达成共同认识。与个体识别相同，鉴定所选择的STR系统应当满足系统效能累计排除概率应≥0.9999。在此统计标准前提下，所选STR的个数和种类可以自行确定。PCR-STR的结果是用银染的方法还是用基因扫描的方法，虽然没有定论，但是笔者认为在实验条件允许的前提下，银染的方法应当逐步被取代。首先，银染方法工作等，不能大量快速提供结果，不能满足遗传流行病学海量数据的要求；其次，银染结果需要有经验的技术人员判读，否则错误分型的结果不可避免。即使如此，在特殊基因座基因型的解读中，如THO1 9.3/10杂合型在银染胶中几乎是不能被识别的［6］。从技术发展方向来看，自动化程度高的荧光PCR-STR将成为主流技术。本文采用了符合国内亲子鉴定技术标准的技术体系完成双生子卵型鉴定。(3)异卵双生子卵型鉴定需要注意的一个问题是双生子来源于不同生物学父亲的问题。这一现象早在1978年就被科学家发现，虽然该现象不是非常普遍，但是将影响我们的科学研究的准确性。因此，双生子卵型鉴定是否需要父亲的参加成为一个问题［7］。此外，在本研究中D-02个体在D18S51基因座出现与其父不符合基因型，其父为21/21，D-02为15/20。根据亲子鉴定标准，追加D18S1364等9个基因座后确定为D-02个体在D18S51基因座发生了STR单步突变［8］。异卵双生子中一个个体完整地继承了父亲的基因型，而另一个体发生了基因突变。如果生物学父亲不参与卵型鉴定，我们无法确定客观事实。因此，笔者认为，双生子所涉及的遗传流行病学研究的设计应当考虑生物学父亲参与这一问题。在双生子登记系统中，依照研究环境尽可能增加此项排除条件，因为同母异父的同胞与双生子有截然不同的遗传流行病学研究价值。考虑到上述因素，本文在鉴定中都记录和分析了双生子父亲的遗传信息。
综上所述，PCR-STR基因扫描是双生子卵型鉴定的理想方法，其合理有效的利用将为遗传流行病学的研究带来新的科学积累。
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(本文编辑：乔 雨)
作者单位：1 100081 北京协和医学院研究生院(原中国协和医科大学研究生院) 2 北京，国家人口计生委科学技术研究所遗传优生研究中心