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【摘要】 目的 研究外周血中CK19与原发性乳腺癌组织中CK19表达与临床分期及淋巴结转移的相关性。方法 应用免疫组化技术及RT-PCR，对43例原发性乳腺癌进行癌组织中和血清检测，并检测其与分期间的关系。结果 正常乳腺组织及癌组织中CK19在表达程度上无明显差异(P>0.05);在未转移淋巴结中，CK19呈阴性表达，而在转移淋巴结中呈阳性表达。不同分期的患者血液中CK19 mRNA表达存在差异(P<0.05);淋巴结转移组与未见淋巴结转移组比较，也有统计学差异(P<0.05)，而在不同组织类型乳腺癌组别之间则无统计学意义(P>0.05)。结论 采用RT-PCR检测乳腺癌患者淋巴结及外周血中肿瘤细胞具有高灵敏度，对乳腺癌预后判断具有重要应用价值。
【关键词】 乳腺肿瘤 RT-PCR 角蛋白质类 肿瘤转移
Expression of CK-19 in carcinoma tissue and peripheral blood of breast cancer patients
ZHANG Jian-li，MA Jin-hai，MENG Jian-bin.Department of Oncosurgery,The Second Hospital of Baoding,Bading 071051，China
Objective To investigate the associativity between the expression of CK19 in peripheral blood and primarybreast cancer tissue with the clinical stage and lymph node metastasis.Methods To detect the peripheral blood and primary breast cancer tissue of 43 patients by RT-PCR and immunity histochemistry method，and appraise the relation of result and clinical stage.Results There was no obvious difference of the expression level between normal tissue and carcinoma tissue(P>0.05).The CK19 was negative expression in lymph node without metastasis，but positive expression in lymph node with metastasis，and the expression of CK19 mRNA was different between diverse clinical stages in patient’s blood(P<0.05)，the result of the group of lymph node without metastasis and with metastasis was same.There was not statistically significant in different tissue-type groups(P>0.05).Conclusion The potential value is suggested to evaluate the prognosis on the detection of CK19 mRNA level in peripheral blood and lymph nodes by RT-PCR techniques.
[Key words] breast tumor;RT-PCR;CK19;tumor metastasis
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，早期检测并正确评估患者的转移风险对预后判断、选择合理治疗有积极的临床意义。本研究利用以上皮源性细胞特异性标志基因——细胞角蛋白19(CK19)的表达为标志物，应用免疫组化技术及RT-PCR，对2007年1月至9月43例原发性乳腺癌进行癌组织中和血清检测，并探讨CK19在原发性乳腺癌组织及血清中表达的临床意义。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取2007年1月至9月在本院住院手术并经病理证实的乳腺癌患者43例，均为女性，年龄41～67岁，中位年龄53岁，临床TNM分期为Ⅱ、Ⅲ期。其中Ⅱ期32例，Ⅲ期11例。病理分型为：浸润性导管癌24例，浸润性小叶癌14例，黏液腺癌5例。另以健康女性10例为正常对照。
1.2 标本来源 (1)43例乳腺癌患者的组织标本分为癌组织和癌旁组织(距癌组织边缘4.0 cm)，腋下淋巴结标本取自术中;将切取的癌组织、癌旁组织和淋巴结置于4%甲醛溶液中固定，逐级脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋、保存备用，用于免疫组织化学检测。(2)清晨空腹抽取10例健康女性及乳腺癌患者全血5 ml，置于含有EDTA的抗凝管中备用。
1.3 免疫组织化学染色
1.3.1 免疫组化染色 蜡块切片厚度为4 μm，切片后一份用于HE染色，一份用于免疫组化检测(S-P法)。在每张免疫组化的切片上滴加CK19小鼠抗人的单克隆一抗(北京中山生物公司)，阴性对照片采用PBS代替一抗，及兔抗小鼠二抗;显色，封片后，光镜下观察。
1.3.2 阳性标准 CK19阳性染色部位为细胞质和细胞膜。任意选取5个高倍镜视野进行细胞计数;判断标准：染色阳性的肿瘤细胞数占全部肿瘤细胞总数的比例为0%～25%时，免疫组织化学结果为阴(-);25%～50%时，结果为弱阳性(+);50%～75%时，结果为阳性(++);75%～100%时，结果为强阳性(+++)。
1.4 血液中CK19 mRNA的提取 取备用的血液5 ml，以PBS稀释一倍后，采用淋巴细胞分离液(华美生物公司)离心，收集淋巴细胞层，洗涤后移至EP管，加入Trizol裂解液裂解细胞，硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取总RNA。
1.4.1 RT-PCR引物及探针 采用上海生工生物公司合成的CK19引物及探针。
CK19上游引物:5′-AGGTGGATTCCGCTCCGGGCA-3′;下游引物:5′-ATCTTCCTGTCCCTCGAGCA-3′。内参照β-action上游引物:5′-ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG-3′;下游引物:5′-CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3′。
1.4.2 RT-PCR扩增 0.2 ml EP管中顺序加入以下试剂：25 mmol/L MgCl2 25 μl，20×RT-PCR缓冲液(无Mg2+)1.5 μl，10 mmol/L dNPs 0.5 μl，CK19及β-action上游引物、下游引物各0.5 μl，模板RNA 1.5 μl，RT -PCR酶混合物2.0 μl，无菌去离子水至30 μl，离心10 s，加入液状石蜡30 ml，于PCR扩增仪(美国ABI公司)进行基因扩增。CK19循环参数:将提取的RNA经37 ℃反转录50 min，得到的cDNA进行PCR扩增;热循环反应条件为:95 ℃ 5 min预变性，解链45 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸55 s，32个循环，最后延伸5 min。将扩增产物行琼脂糖凝胶电泳，在相应位置上见到460 bp CK19 cDNA条带，内参照β-actin长度为838 bp，则为阳性表达;若无CK19cDNA条带为阴性表达(图1)。
1.5 统计学处理 检测结果结合临床资料数据应用SPSS 11.0统计软件包进行χ2检验，设P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 CK19免疫组织化学检测阳性表达部位 正常乳腺腺体组织中，CK19阳性染色的细胞位于腺管内壁，整个胞浆呈棕黄色，周围间质细胞呈阴性染色，见图2。在乳腺癌组织中，CK19阳性染色细胞分布于腺体组织内，无明显腺管结构，周围间质细胞染色阴性，见图3。两者在表达程度上无明显差异(P>0.05)，见表1。在未转移淋巴结中，CK19呈阴性表达，而在转移淋巴结中呈阳性表达。
2.2 正常对照组与乳腺癌患者外周血CK19 mRNA测定结果 见表2。由表2可见，10例正常健康女性外周血CK19检测均为阴性(0/10)，而在患有43例乳腺癌的女性中27例检测结果为阳性(27/43，62.8%)，经统计两者差异有统计学意义(P<0.01)。Ⅱ期乳腺癌中CK19阳性表达率为53.3%，而在Ⅲ期乳腺癌中CK19阳性表达率高达84.6%，显著高于Ⅱ期患者(P<0.05);乳腺癌淋巴结转移组(24/33，75.0%)与未见淋巴结转移组(3/9，33.3%)比较，差异有统计学意义(P<0.05)，而在不同组织类型乳腺癌组别之间则无统计学意义(P>0.05)。表1 CK19在乳腺癌组织及癌旁组织中的表达表2 正常对照组与乳腺癌患者CK19 mRNA测定结果
3 讨论
细胞角蛋白(cytokeratin，CK)广泛存在于正常上皮细胞和上皮癌细胞中，为细胞骨架的组分之一，细胞角蛋白分子有不同的亚型，已知至少包含20个成员(CK1～CK20)，其中CK19分子量为40×103U在正常上皮细胞和上皮性癌细胞的表达最为特异。正常情况下淋巴结、血液及骨髓中不会产生这种角蛋白，因而在上述组织中发现细胞角蛋白的存在，则意味着微转移的发生[1，2]。因此，选择CK19作为检测指标，应用灵敏度高的逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术为检测手段，可在外周血中检测到微量的乳腺癌细胞[3]。同样在淋巴结的微转移检测中亦可得到相同结果[4，5]，以细胞角蛋白CK19作为组织特异性标志，采用免疫组化的方法，对HE阴性的前哨淋巴结的微转移灶进行检测，结果可使SNB预测腋淋巴结状态的敏感性和准确性大大提高[4]。
理论上来源于上皮组织的细胞均可表达CK19，本实验中乳腺癌组织及癌旁正常腺体组织导管上皮CK19均阳性表达，两者未表现出差异性，说明CK19在确定细胞组织来源上具有一定意义，而对细胞的良恶性诊断不具有鉴别能力;转移的淋巴结中因为存在癌细胞所以呈阳性表达，而未转移的淋巴结中CK19染色阴性，亦证实淋巴细胞及其包膜等来源于非上皮的组织不表达CK19蛋白，从而利用此特点可利用CK19蛋白及mRNA对淋巴结的微转移进行检测。
乳腺癌血行转移与肿块大小及临床分期有密切关系，一般认为，肿瘤的浸润转移特性随着肿瘤体积增大而增强，临床分期越晚，远处转移率越高，本组结果显示，血液中CK19 mRNA阳性表达率随淋巴结转移程度及临床分期的增加而增高，提示血液中癌细胞的数量随临床分期的增加而大大增加，从而远处转移的几率明显增高，预后不良。但不同分型的乳腺癌间血液中CK19 mRNA未显示出差异性，可能与其来源相同，分化相近有关。
本研究提示：肿瘤细胞血行微转移检测，为乳腺癌术前、术后判断病情、指导治疗、动态监测复发提供了更准确的依据。由于乳腺癌早期即存在血行转移可能，分期愈晚转移可能越大这一特点，利用RT- PCR方法在检测乳腺癌患者外周血中肿瘤细胞高灵敏性[6]，对患者远处转移可能做出正确判断和评估，作为临床判断预后的参考，CK19 mRNA检测具有一定的应用价值。
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作者单位：071051 河北，保定市第二医院肿瘤外科