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【摘要】 目的 研究外源性Wnt-3a信号蛋白对脊髓损伤的修复作用，并探讨其作用机制。方法 取40只成年雌性SD大鼠在T10节段制备适度脊髓挫伤模型。随机从中取20只为损伤对照组(Group 1)，另外20只为损伤治疗组(Group 2)。脊髓损伤3天后用Wnt-3a蛋白治疗。这些大鼠的功能恢复通过Basso、Beattie、Bresnahan (BBB)开放视野运动评分来观察。这些大鼠分批在损伤后14天或28天被处死，取出损伤节段脊髓用来组织病理学检查，同时用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)和神经细胞标记物进行免疫组化染色。结果 两组大鼠在伤后一周运动功能有明显的恢复。不过，到损伤后28天，我们观察发现，损伤治疗组中的大鼠BBB评分比损伤对照组中的评分高出7.0分左右(Group 2∶16.94±1.18,Group 1∶9.89±1.29;P<0.05)，光镜和电镜检查发现Wnt-3a蛋白对髓鞘形成和轴突再生有一定的修复效果。免疫组织化学发现，在损伤后2周，Wnt-3a蛋白治疗组诱导分化的神经元数目明显多于损伤对照组。结论 大鼠脊髓损伤施加外源性的Wnt-3a蛋白可以一定程度上促进轴突传导和功能恢复，并且可以促进神经元数目的增加，通过双标染色提示这些神经元来源于内源性神经干细胞。
【关键词】 分化;神经干细胞;大鼠;脊髓损伤;Wnt-3a蛋白
Repair effect of Wnt-3a protein on contused adult rat spinal cord
ZU Bo,YIN Zong-sheng,ZHANG Hui.Anqing Hospital,Anhui Medical University,Anqing 246003,China
Objective To evaluate the functional recovery of acute spinal cord injuried rats treated with exogenous Wnt-3a signal protein administration and to explore its mechanism.Methods Moderate spinal cord contusion injury was made in 40 adult Sprague Dawley (SD) rats at T10.Twenty rats served as contusion controls(group 1).Twenty rats were treated with Wnt-3a for three days after injury (group 2).The functional recovery of the rats was observed through Basso,Beattie,Bresnahan (BBB) open field locomotor score.Rats were killed at 14 or 28 days after injury,then spinal cords were removed for histopathological examinations,and the expression of the bromodeoxyuridine (BrdU) plus neural cell markers was stained with immunohistochemical method.Results Rats of two groups receiving a contusive injury recovered substantial function within 1 week.By 28 days,rats in groups 2 scored 7.0 points better on the BBB scores than rats in group 1 (group 2=16.94,after 28 days vs. group 1=9.89 points;P<0.05).Light and electron microscopic studies showed that the Wnt-3a treated group had moderate repair effect of myelin and axons.Immunohistochemical analysis showed significant increases in the number of the inducing differentiated neurons in Wnt-3a-treated rats compared with control rats two weeks after injury.Conclusion Exogenous Wnt-3a administration can improve axonal conduction and increase of spinal cord function in the injured spinal cord,and the administration of Wnt-3a result in the populations of neurons,suggesting that these cells may be derived from endogenous neural stem cells.
[Key words] differentiation;neural stem cells;rat;spinal cord injury;Wnt-3a protein
脊髓损伤患者的治疗仍缺乏有效的手段，近年来，神经干细胞(neural stem cells,NSCs)治疗脊髓损伤已成为一大热点。然而，最近的研究发现，外源性的神经干细胞移植到损伤区域主要分化为星形胶质细胞[1]，参与胶质瘢痕的形成，抑制轴突的再生。 内源性神经干细胞的发现为治疗脊髓损伤提供一条新的途径。这些内源性神经干细胞可以由于损伤或生长因子治疗得到刺激，并能被诱导分化为神经元代替损伤的透射神经元[2]。同时，近年来有关Wnt信号途径对神经干细胞的作用逐渐引人注意，因其启动信号为Wnt蛋白而得名。Wnt-3a是Wnt基因家族中重要成员，最近的一些研究发现， Wnt-3a信号蛋白对神经干细胞的定向分化的调控作用表现的十分明显。 笔者将外源性Wnt-3a信号蛋白施加到挫伤性脊髓损伤区域，而后观察实验动物脊髓功能恢复情况，旨在探索出一条脊髓损伤治疗新的有效途径。
1 材料和方法
1.1 实验及动物分组 成年雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠40只,体重200~250 g,由安徽医科大学动物实验中心提供。成年雌性Sprague-Dawley大鼠按体重从小到大编号,将这些动物分为两组：对照组(Group 1,n=20)和实验组(Group 2,n=20)。
1.2 急性脊髓挫伤型模型的制备 所有大鼠用2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉后,后路显露 T10脊髓。用 Allen 法制成脊髓背侧损伤动物模型，损伤力度为(10 g×2.5 cm)25势能克厘米力(gram-cm force,gcf)。损伤治疗组及损伤对照组大鼠3天后经历二次手术，再次暴露脊髓。脊髓治疗组用微电极推进器在原脊髓损伤区域缓慢注入6 μl Wnt-3a重组蛋白(浓度 50 ng/ml)，深度约1 mm,留针5 min。损伤对照组在同样部位给予同等剂量生理盐水。
1.3 行为学评分 为了评价脊髓损伤后的运动功能变化，实验动物分别在术前,术后1、7、14、21、28天进行运动功能评分(basso beattie bresnahan，BBB)[3]。BBB评分是观察动物的臀﹑膝﹑踝关节行走,躯干运动及其协调情况。
1.4 组织学观察 分别在脊髓损伤后14天、28天处死等量动物(n=4)。腹腔麻醉后,自左心室通过静脉导管用冷的4%多聚甲醛固定液灌注后，取出损伤节段和相邻节段长约0.8 cm的脊髓组织。一部分脊髓组织移入4%多聚甲醛固定6 h,依次移入20%和30%的蔗糖溶液中直至沉底,然后脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋,水平面连续切片,片厚5 μm,行HE染色，观察光镜下的结构变化。另一部分脊髓组织分成1 mm3大小组织块先后固定于2.5%的戊二醛、1%的锇酸中，随后在梯度乙醇中脱水，用环氧树脂将组织包埋后，进行超薄切片，片厚70 nm,入枸橼酸铅染液后，在透射电镜下观察脊髓组织超微结构的变化。
1.5 免疫组织化学检测 同样在脊髓损伤后14天、28天处死等量动物(n=4)，按上述方法灌注固定后，常规冰冻切片机切片，片厚15 μm，行免疫荧光组织化学检测，同时进行细胞计数。为分析损伤区域的增值反应，在灌注前48 h每12 h腹腔注射0.1 mg/g BrdU(浓度10 mg/ml)。BrdU标记增殖的神经干细胞; MAP-2标记神经元; GFAP标记星形胶质细胞;按照试剂盒步骤操作,一抗分别用BrdU、 MAP-2、GFAP,4 ℃过夜,后加入对应的FITC或TRITC标记的荧光二抗，室温下避光2 h，PBS漂洗后，缓冲甘油封片。阴性对照采用磷酸缓冲液(PBS)代替一抗。于荧光显微镜观察实验结果。
1.6 统计学处理 实验数据用(x±s)表示，采用SPSS 11.5统计软件包进行统计分析，两组间BBB评分及双标阳性细胞数采用两样本的t检验。对于双标阳性细胞计数， 随机计数8个400倍镜下视野， 取平均值获取实验结果。P<0.05差异具备显著性。
2 结果
2.1 行为学检测结果 具体的BBB评分结果见表1。脊髓损伤后28天，Wnt-3a蛋白治疗组BBB评分明显高于损伤对照组(Group 2=16.94,after 28 days vs Group 1=9.89 points;P<0.05)。值得注意的是，在损伤对照组，其BBB评分在损伤后14天基本达到最高值，而Wnt-3a蛋白治疗组直到损伤后28天BBB评分仍继续增加。表1 实验组、对照组各阶段BBB运动功能评分
2.2 组织学观察结果
2.2.1 光镜观察 损伤对照组在脊髓损伤后14天，神经纤维排列稀疏、断裂,胶质细胞增生,瘢痕形成(图1A)。在损伤治疗组，HE染色组织学形态稍好于损伤对照组(图1B)。在脊髓损伤后28天，灰质神经元和白质神经纤维逐渐恢复，损伤对照组中间质可见大量胶质细胞形成(图1C)，损伤治疗组组织形态学明显好于损伤对照组，基本接近正常脊髓组织(图1D)。
2.2.2 电镜观察 损伤对照组在脊髓损伤后14天，髓鞘扭曲﹑分层和崩解,轴浆肿胀，轴突内线粒体嵴突消失,空泡样变性(图2A),但在损伤治疗组白质轴索变性程度明显好于损伤对照组(图2B)。到脊髓损伤后28天，损伤治疗组超微结构明显好转，只可见少量轴索变性，轴浆内线粒体肿胀情形明显减轻，绝大部分可见嵴突(图2C)。而在损伤对照组，虽然超微结构较损伤后14天有所好转，但轴浆和线粒体仍较肿胀，微管、微丝稀松，髓鞘壁变薄，部分线粒体可见嵴突(图2D)。
2.3 免疫组织化学结果 我们在脊髓损伤区域发现BrdU和MAP-2双标阳性的细胞，特别在蛋白移植的灰质区域及附近。通过数据统计，损伤治疗组每个400倍下视野可见20.5±5.2 BrdU+/MAP-2+双标阳性新生神经元，而在损伤对照组可见12.5±4.3，BrdU+/MAP-2+双标阳性新生神经元(n=8,P<0.05) (图 3)。然而，到损伤后28天，两组之间双标阳性新生神经元数没有明显统计学意义(Group 2：9.8±4.5，Group 1：7.8±3.6;P>0.05)。此外，通过双标免疫荧光，我们发现在脊髓损伤后14天，损伤治疗组每个400倍下视野可见5.6±1.7 BrdU+/GFAP+双标阳性新生星形胶质细胞，而在损伤对照组可见16.9±5.9 BrdU+/GFAP+双标阳性新生星形胶质细胞(n=8,P<0.05)(图4)。同样地，这种治疗效果不能维持很长时间，在损伤后28天两组之间未见明显的区别(Group 2：6.1±2.7，Group 1：5.1±1.9;P>0.05)。
3 讨论
脊髓组织容易因为各种原因导致损伤。损伤的结果导致神经回路的中断，同时大量神经元坏死导致功能丧失。干细胞生物特性研究的进展， 为恢复脊髓损伤后丧失的神经生理功能提供一种合适的方法。这种在损失区域诱导再生的策略具体的可以划分为两种方法：(1)细胞移植治疗;(2)内源性神经干细胞的激活[4,5]。
不过，最近的研究显示神经干细胞的移植主要分化为星形胶质细胞， 从而抑制轴突的再生。 此外， 在干细胞移植过程中， 伦理道德因素、机体免疫排斥反应、肿瘤形成及功能问题仍未能解决， 这些都影响外源性神经干细胞的移植治疗[6]。 相比 而言， 内源性神经干细胞有着显而易见的优势: 无伦理学问题;无免疫源性,不需抗排斥治疗;同样具备自我更新和多向分化的能力;无生物安全性问题; 操作简便等[7]。
人们已经研究发现，哺乳动物的成体神经前体细胞或神经干细胞在中枢神经系统损伤或疾病情形下有增殖反应[8]。由此可以设想，内源性神经干细胞的调控将是神经变性疾病和中枢神经系统损伤一种可以选择的治疗方法。也是干细胞移植治疗的补充。不过，理解神经干细胞在中枢神经系统损伤情形下分化机制是利用这种策略进行治疗的关键。神经干细胞分化方向是由外在的信号因素和内在的遗传机制复杂的相互作用所决定。Yamamoto等[9]提出两种方法：(1)在损伤的部位注入生长因子， 刺激内源性神经干细胞增殖， 并利用其神经保护作用促进神经元分化;(2)抑制微环境中的负性信号促进内源性神经干细胞向神经元分化。
Wnt信号蛋白是近几年来逐渐被人们认识的一类信号分子。在哺乳动物中，Wnt细胞信号蛋白家族至少由19种成员组成,在细胞生长和发育过程中发挥重要作用[10]。最近，Wnt这类脂质蛋白被发现可以在神经干细胞培养液中促进神经干细胞的神经元的分化[11]。然而， Wnt信号途径对体内脊髓损伤是否有修复作用尚不清楚。
通过实验结果，我们发现Wnt-3a蛋白治疗组在脊髓损伤后4周BBB运动评分明显高于损伤对照组(P<0.05)，并且组织学观察提示在实验明显好于对照组。同时，Wnt-3a蛋白治疗组在损伤后14天BrdU+ /MAP-2+阳性的新生神经元数目明显多于对照组数目(P<0.05)。但是，在对照组中，BrdU+/GFAP+阳性新生星形胶质细胞数目明显少于在实验组中的数目。这些说明Wnt信号途径能促进内源性神经干细胞分化为神经元，同时抑制星形胶质细胞的分化。由此可以看出， Wnt信号途径不论在体内或是体外对神经干细胞都发挥新颖的作用和效果。 通过实验， 我们发现脊髓损伤区域施加Wnt-3a信号蛋白可以促进脊髓损伤一定程度的恢复。
不过，在脊髓损伤后的28天，Wnt-3a蛋白的作用明显减弱。BrdU+/GFAP+双标阳性细胞数或BrdU+/MAP-2+双标阳性细胞数在Wnt-3a蛋白治疗组和损伤对照组之间未见明显的区别(P>0.05)。这些结果表明，这种治疗方法不能获得长期、局部、高浓度的生长因子治疗作用。为了获得这种治疗作用，可以采用体内基因治疗方法。体内基因治疗包括从宿主组织中分离细胞、体外基因修饰及表达产物的活性鉴定，随后将基因修饰的细胞移植到宿主中[12]。我们下一步研究将打算移植Wnt-3a基因转染的神经干细胞，观察其治疗脊髓损伤的效果。
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