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【摘要】 细菌多重耐药性的传播和扩散已经越来越严重，给临床治疗带来诸多的困难，使得抗菌药物在临床上的应用引起很大的争议。细菌可以通过多种方式逃避抗菌药物的治疗，而整合子系统是近年来研究的热点，细菌通过整合子系统获得外源性耐药基因，并在位于整合子上游的启动子的作用下表达，介导细菌耐药及多重耐药。本文主要对整合子系统的耐药机制进行探讨。
【关键词】 基因盒;整合子;多重耐药
近年来，细菌对抗生素的耐药性不断上升及耐药性的快速传播已经成为临床感染性疾病治疗的难题。研究表明，细菌的耐药性大多在外环境下经可移动的遗传因子，如质粒、转座子、噬菌体、整合子等的传递获得。目前，由具有捕获及表达外来耐药基因盒能力的整合子系统介导的细菌耐药机制越来越引起学者们的关注，其对多重耐药研究有着非常重要的意义。整合子系统是1989年由Stokes HW 等[1]首次提出。1991年Hall通过对转座子Tn7上各种不同耐药基因的分析,正式提出了基因盒—整合子系统的概念。这些基因盒—整合子系统多见于革兰阴性杆菌,以肠杆菌、铜绿假单胞菌多见,但在谷氨酰棒状杆菌上也存在。整合子是具有位点特异性重组功能的基因决定子,能识别并捕获移动性基因盒。基因盒是整合子上所携带的基因片段,常携带耐药基因。本文就整合子的结构与分类,基因盒种类与结构以及细菌的耐药性等方面的研究进行综述。
1 基因盒
近10年来学者们已经发现了60多个基因盒，它们大多为抗菌药物的耐药基因，包括最初发现的编码氨基糖苷类及氯霉素钝化酶的基因，编码磺胺类、β-内酰胺类耐药性的基因以及新近发现的编码超光谱β-内酰胺酶和碳青霉烯水解酶的基因盒[2]。这些基因盒— 整合子系统多见于革兰阴性杆菌,以肠杆菌、铜绿假单胞菌为多见,但最近在1株革兰阳性杆菌(谷氨酰棒状杆菌)中也发现了该系统,且耐药水平的表达强于革兰阴性杆菌[3]，这为基因盒—整合子系统在细菌耐药机理的研究提供了新的方向。
基因盒是比较小的、可移动的DNA分子,常以环形独立状态存在,只有在整合酶作用下整合到整合子中才能转录[2]。基因盒的长度从262到1549bp不等,包括结构基因和一个特异性重组位点(59base element,简称59 be或attC)的结构,结构基因占据了基因盒的大部分区域,主要编码对抗生素的抗性,结构基因两侧还含有小段非编码区域。59 be重组位点位于该基因下游,每个基因盒所含的59be序列和长度不尽相同,其长度为57到141 bp 不等,该序列为整合酶的识别位点。目前, 59 be重组位点为一些不完全的反向重复序列,呈二倍轴对称,其5′端与基因盒基因编码区3′端反向核心序列RYYYAAC (R 代表嘌呤, Y代表嘧啶)为界, 3′端则与核心序列G’TTRRRRY为界。在整合过程中,重组交换发生在59 be重组位点的3′端7 bp核心位点保守的G'TT中(G与第一个T之间) ,这种59 be特殊结构为基因盒的插入及基因盒的功能表达提供了重要的结构基础。基因盒通过整合到新位点完成耐药基因的流动,生成新的整合子,同时还产生多种复合重组位点。
2 整合子
整合子是保守、可移动的转座子样DNA元件,不仅可以通过位点特异性重组系统在细菌间传播,而且具有捕获和整合耐药基因的功能。结构上含有两端的高度保守片段(conserved segment, CS)和中间的可变区(Variable region),系水平基因传递(hor2izontal gene transfer, HGT)系统[2]，它由DNA整合酶基因(int)和两个重组位点attI和attC (59 bp片段重组位点)组成。Int位于5′末端，属于酪氨酸整合酶家族，催化基因盒在attI和attC上的整合及切除，被整合子捕获的基因盒5′端与attI结合, 3′端的59bp片段与attC特异性重组。虽然每个基因盒59 bp交换位点长度从57到141个碱基不等,但有相同的特点，它们的5′端与基因盒基因编码区3′反向核心序列RYYYAAC (R代表嘌呤, Y代表嘧啶)为界，3′端则与核心序列(GTTRRRRY) 为界，中间含有1个60 bp的共同不完全反向重复序列。
整合子的种类是根据整合酶基因int I的序列不同划分的,目前已发现六类整合酶,其中第一类整合子最常见[3],它的整合酶是含有337个氨基酸的蛋白,大多数的3′保守端包括季铵盐化合物及溴乙啶的耐药基因(qacE△1) 、磺胺类耐药基因(sul I)、功能不明的(ORF5) ,其3′端保守序列中的耐药基因并非耐药基因盒,因为它不含有重组位点attC,为非移动基因元件。int I 2基因的产物与int I 1的产物有46%的同源性,其3′保守端有5个编码张力蛋白的tns基因性与转座子移动有关,较Ⅰ类整合子少12个氨基酸。参与Tn7 转座机制的基因组成，中间的可变区域携带有耐药基因的基因盒[4,8]。在多重耐药的宋内志贺菌中有人检测到整合子，另有报道[5]还存在一种嵌合整合子,表明自然界中可能发生Ⅰ、Ⅱ类整合子间的重组。核苷转移酶基因aadA1a、甲氧苄啶基因及链丝霉素基因( sat)等基因盒位于Ⅱ类整盒子上。第三类整合子的int I 3 基因与int I 1 有61%的同源性。目前,只发现碳青霉烯耐药基因位于该整合子上[5] ,其余结构及功能尚在研究中。第四类整合子主要存在霍乱菌株中,被称作超级整合子(super 2 integrons, SI) ,它远大于传统整合子[6],可以携带数百个基因盒,说明这类整合子有捕获基因盒的超常能力,其整合酶也有位点特异性重组活性及类似59 碱基单元(baseelement, be)结构,含100 多种基因盒,是一种新型霍乱弧菌基因组中的整合子,与抗生素耐药无关。编码生化功能或毒力，除了具有耐药基因外,还具有致病基因等[6]。
3 整合子对基因盒的捕获
整合子在整合酶的催化下,通过整合酶在59be的特定识别位点,能将游离的耐药基因盒整合到自身DNA上[7]。耐药基因盒的表达依赖位于整合子5′保守区域的启动子,通常整合子包含两个启动子。在启动子的作用下,耐药基因得以表达。线性基因盒整合于位点attI上,只存在一种方向( 5′→3′) ,多个基因盒都是按照同样方向排列,这种位向特异性有利于启动子带动所有下游基因盒的表达,特异性整合是将耐药基因盒整合到交换位点attI和attC (59 be位点),耐药基因盒可以自由地被整合和切除[8]。非特异性整合耐药基因盒并不结合于attI和attC交换位点,而结合于整合子的非特异性交换位点,一旦整合上后,则不能被切下。这对于细菌的耐药基因传播和细菌的进化有重要意义。
4 耐药基因的传播
抗生素耐药基因的水平传播导致了临床细菌产生耐药性,而耐药基因形成运动性基因盒的一部分加速了耐药基因的水平传播。当游离的基因盒被整合酶识别捕获到整合子上,并使之表达,就会产生对某些抗生素的耐药性。携带着重组基因盒的整合子插入到转座子或接合性质粒中,在不同种属细菌中运动而传播耐药性,使得耐药菌群的种类及数量迅速增加。
通过对基因盒—整合子结构的研究,发现它在很大程度上影响着细菌基因组的进化。首先,从前4种整合酶的同源性程度(45%～61%)可以认为它们的进化时间很长,远远超过50多年抗生素使用时间,特别是超级整合子作为一种古老的结构,长期指导宿主基因的进化。另外,基因盒的遗传性状不仅仅局限于耐药性,还编码多种适应功能蛋白,很少编码细菌生命活动所必需的功能,即细菌通过捕获多种来源的基因盒来增强对环境的适应能力,而且任何开放读码框架都可能被构成基因盒,所以细菌可利用的基因盒资源是巨大的,整合子对细菌基因进化所起的作用也是相当大的。总之,细菌基因盒—整合子的发现为细菌耐药机制的进一步研究提供了新思路,也为抗生素的开发和利用以及如何延长其使用寿命和控制细菌耐药性的发生发展等指明了新方向。
【参考文献】
1 Hall RM, Brookes DE, Stokes HW. Site specific Insertion of Genes into Integrons : Role of the 592base Element and Determination of the Recombination Cross2over Point. Mol Microbiol,1991, 5: 1941-1953.
2 Rech GD, Hall RM. Gene Cassettes: A New Class of Mobile Element. Microbiology, 1995, 141:3015-3027.
3 Fluit AC, Schmitz FJ. Class 1 Integrons, Gene Cassettes, Mobilityand Ep idemiology. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 1999, 18(11):761-773.
4 Goldstein C, LeeMD, Sanchez S. Incidence of Class 1 and 2 Integrases in Clinical and Commensal Bacteria from Livestock, Companion Animals, and Exotics. Antimicrob Agents Chemother,2001, 45 (3):723-735.
5 Rowe 2Magnus DA, Guerout AM, Mazel D. Super2integrons.ResMicrobiol, 1999, 150 (9-10):641-657.
6 Collis CM, Kim MJ Partridge SR, et al. Characterization of theClass 3 integron and the Site2specific Recombination System ItDetermine. Bacteriol, 2002, 184(11):3017-3026.
7 Peters EDJ, Hall MAL, Box ATA, et al. Novel Gene Cassettes and Integrons. Antimicrob Agents Chemother, 2001, 45(10):2961-2976.
8 Kazama H, Hizu K, Iwasaki M, et al. A New Gene, aadA2bEncoding an Aminoglycosideanylyl TransreaseAAD(3") , Isolated from Integron InC in Peseudom onas aerruginosa. Micro,1996, 86: 77-86.