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首页医源资料库在线期刊中华现代临床医学杂志2010年第8卷第10期

表面抗原和表面抗体同阳性乙型肝炎患者HBV S基因“a”决定簇分析

来源:中华现代临床医学杂志
摘要:【摘要】目的探讨表面抗原和表面抗体同阳性乙型肝炎患者HBVS基因“a”决定簇序列特征。方法采用PCR技术对4例表面抗原和表面抗体同阳性乙型肝炎患者HBVS基因进行扩增,扩增产物采用DNA测序技术对S基因进行序列分析,并和NCBIHBV数据库进行比对。结论HBVS基因“a”决定簇序列多态性是表面抗原和表面抗体同阳性......

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【摘要】  目的 探讨表面抗原和表面抗体同阳性乙型肝炎患者HBV S基因“a”决定簇序列特征。方法 采用PCR技术对4例表面抗原和表面抗体同阳性乙型肝炎患者HBV S基因进行扩增,扩增产物采用DNA测序技术对S基因进行序列分析,并和NCBI HBV数据库进行比对。结果 4个标本中,其中3个标本“a”决定簇序列没有变化,1个标本的126位氨基由异亮氨酸(I)置换为丝氨酸(S),129位氨基酸由谷酰胺(Q)置换为精氨酸(R),130位氨基酸由甘氨酸(G)置换为天冬酰胺(N),133位氨基酸由甲硫氨酸(M)置换为苏氨酸(S)。结论 HBV S基因“a”决定簇序列多态性是表面抗原和表面抗体同阳性的重要原因之一,但并非唯一因素。

【关键词】  乙型肝炎;HBVS基因

 HBsAg与HBsAb理论上在同一患者中不可能同时检出。但事实上,两者的同时检出在临床实践中并不少见[1],国内外报道乙肝患者中其检出率为2.7%~9.15%[2]。HBsAg与HBsAb同阳性被认为与HBV S基因“a”决定簇等因素密切相关,本文就4位HBsAg与HBsAb同阳性乙型肝炎患者HBV S基因“a”决定簇进行了测序分析,以其研究“a”决定簇序列多态性在HBsAg与HBsAb同阳性患者中的意义,现报告如下。

  1 材料和方法

  1.1 一般资料

  4例HBsAg和HBsAb双阳性乙型肝炎患者标本收集于2009年3—6月临汾市传染病医院,诊断标准符合2000年第十次全国传染病与寄生虫病会议制定的《病毒性肝炎防治方案》。血清分离后,-80 ℃保存备用。

  1.2 仪器和试剂

  ABI7300荧光定量PCR仪(美国);GeneGenius凝胶成像系统(英国Syngene公司);dNTP、Taq DNA聚合酶(Takara公司);各种限制性内切酶、T4DNA连接酶和克隆载体pGEM-T(Promega公司);引物合成由上海生工生物工程有限公司完成,ABI PRISM310型核苷酸序列分析仪,末端标记试剂BigDye(ABI公司),PCR产物纯化试剂盒(Qiagen公司)。

  1.3 方法

  1.3.1 血清HBV DNA提取

  100μl血清加300μl TES溶液,混匀震荡,65℃水浴2h,氯仿抽提2次,无水乙醇沉淀,DNA溶解于50μl TE溶液中,-20℃保存备用。

  1.3.2 HBV S基因的PCR扩增

  采用PCR法扩增 HBV的S基因序列,引物序列:HBsAg-S: 5'-ATGGAAAGCATCACATCAGGATTCCTA-3';HBsAg-A: 5'-TTAAATGTATACCCAAAGACAAAAG -3'在ABI7300实时定量PCR仪上进行PCR检测, 25μl的PCR反应体系中含有3μl DNA(终浓度20ng), 引物1μl的HBsAg-S, 1μl 的HBsAg-A, 1μl dNTP, 10×Buffer 2.5μl ,Taq酶 0.2μl, 去离子水定容至25μl。 PCR参数:94℃ 预变性5min, 94℃ 30s, 55℃ 30s, 72℃ 1min, 40个循环, 72℃ 7min, 经1%琼脂糖凝胶电泳检测,对PCR产物用Qiagen PCR纯化试剂盒纯化。

  1.3.3 PCR产物纯化及末端标记

  纯化后的PCR产物用10μl dd H2O溶解,末端标记采用5μl反应体积,其中模板1μl,BigDye反应混合物1μl,测序引物1μl,H2O 2μl,反应条件为:96℃ 2min、96℃ 15s、55℃ 10s、60℃ 4min,26个循环。

  1.3.4 测序产物的纯化和测序前准备

  测序产物纯化采用醋酸乙醇沉淀法,测序产物中加入16μl醋酸钠-乙醇混合物(3M NaAc:无水乙醇=1:15),剧烈震荡,避光静置15min,4℃ 12000r/min离心15min,沉淀用70%乙醇洗涤2次,室温干燥,加入10μl Hi-Di去离子甲酰胺溶解DNA95℃ 4min,4℃ 4min,上机电泳。

  1.3.5 测序分析

  测序结果于美国NCBI网站GenBank数据库的标准HBV DNA序列数据相比较,分析确定乙型肝炎的变异位点。

  2 结果

  2.1 PCR产物电泳分析

  采用PCR法扩增 HBV的S基因序列,通过HBsAg-S和HBsAg-A引物扩增的结果显示,结果为680bp左右,与预计的片段大小相等。

  2.2 HBsAg S基因的“a”决定簇序列分析

  利用PCR产物直接测序法对HBsAg S基因测序结果显示,4例HBsAg和HBsAb双阳性乙型肝炎患者的S基因“a”决定簇序列只有1例发生了明显变化,其他3例并没有变化,结果见图1。图2为标本1的测序结果,显示了其是标准的突变菌株,并没有明显的野生株和突变株共存的状态。其中1号标本的126位氨基由异亮氨酸(I)置换为丝氨酸(S),129位氨基酸由谷酰胺(Q)置换为精氨酸(R),130位氨基酸由甘氨酸(G)置换为天冬酰胺(N),133位氨基酸由甲硫氨酸(M)置换为苏氨酸(S)。注:1、2、3、4分别代表标本,ck代表标准株(1号标本的126位点、129位点、130位点和133位点发生了突变)图1 HBsAg S基因“a”决定簇124-147氨基酸位点比较结果图2 1号标本测序结果

  3 讨论

  S基因位于核苷酸(nt)第155~833位,编码226个残基的外膜主蛋白即HBeAg,后者是引起机体产生保护性免疫的主要成分,它有一个免疫优势表示称为“a”决定簇,在所有亚型中均存在。“a”决定簇位于氨基酸(aa)124~147位,是HBV各亚型的共同决定簇,有一定的空间构型。“a”决定簇中有一些位点具有高度的结构依赖性,其中的氨基酸发生替代可改变空间结构,导致乙肝表面抗原的免疫原性及抗原性改变,其变异多发生在126,129,133,141,144和145等位点,一般认为145位甘氨酸变为精氨酸的免疫逃避比较重视,Chiou等[3]将“a”决定簇126、129、145aa变异的S基因进行克隆表达,再用抗一HBs单克隆抗体测定表达的S蛋白,所有变异株表达的S蛋白与抗HBs的结合力均明显下降。张振华等[4]研究发现,部分HBsAg与抗一HBs双阳性乙型肝炎患者HBV“a”决定簇126、130、131及133等位点更容易出现变异。Colson等[5]发现HBsAg和抗一HBs同时阳性的乙型肝炎携带者比HBsAg阳性和抗一HBs阴性的乙型肝炎患者HBV“a”决定簇变异性高。目前,认为免疫压力下,HBsAg变异而发生免疫逃逸是主要原因,近年的大量实验研究证实,HBV 具有准种的特点,而本文的1例标本中4个位点同时存在(126、129、130和133位点),却没有145位点的变异,一个双阳标本中“a”决定簇存在多种突变非常少见,可能和目前核苷酸类药物的治疗密切相关,造成了准种的多样性。而另外3个标本双阳患者HBV S基因“a”决定簇序列并没有发生变化,说明HBV S基因“a”决定簇序列多态性是表面抗原和表面抗体同阳性的重要原因之一,但并非唯一因素。乙型肝炎表面抗原和抗体同时阳性的情况并不少见,试剂质量和实验室操作水平也是影响结果的重要因素[6]。因此分析HBV的S基因序列的多样性对于进一步研究HBV S基因变异和改进现行乙肝疫苗和诊断试剂具有重要参考价值。

【参考文献】
   1 Colson, P., et al. Clinical and virological significance of the co-existence of HBsAg and anti-HBs antibodies in hepatitis B chronic carriers. Virology, 2007, 367, 30-40.

  2 Wang, Y.M. Serological profiles of hepatitis B carrier patients in Singapore with special reference to the frequency and significance of concurrent presence of HBsAg and anti-HBs. Singapore Med J, 1996, 37, 150-152.

  3 Chiou ttL, Lee Ts, Kuo J, et al. Altered antigenicity of?a'determinant Variants of hepatitis B vires. J of Gen Viro1, 1997, 78: 2639.

  4 张振华, 彭静, 夏剑波, 等. 表面抗原和抗体双阳性慢性乙型肝炎病毒感染者病毒S基因的变异分析. 中华肝脏病杂志, 2009, 7(4): 266-270.

  5 Colson P, Borentain P, Motte A, et al. Clinical and virologicalsignificance of the co.existence of HBsAg and anti. HBs antibodiesin hepatitis B chronic ean'iers. Virology, 2007, 367(1): 30-40.

  6 肖征, 周光. 对血清中乙型肝炎表面抗原与表面抗体同时阳性现象的探讨. 中华医院感染学杂志, 2008: 1554-1555.

  

作者: 闫国强 2011-6-29
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