缺氧诱导因子研究进展*

【关键词】  缺氧诱导因子;HIF;肿瘤

　　氧代谢的平衡对于机体的生理功能和代谢过程极其重要，机体对于低氧或者缺氧的条件具有适应能力。缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factors，HIF)是细胞在基因转录水平协调缺氧变化的最主要的调节因子，广泛表达于哺乳动物各种组织细胞中，是一种介导哺乳动物细胞内低氧反应的核转录复合体，其表达调控与肿瘤发生发展和某些疾病的病理生理过程密切相关。本文综述近年来有关HIF激活机制、生物功能和与疾病关系等方面的研究进展。

　　1HIF的分子结构

　　HIF是由结构同源的α亚基和相同的β亚基组成的异二聚体转录因子，目前已发现HIF-1、HIF-2、HIF-3三个成员。HIF-1是一种随细胞内氧浓度变化而调节基因表达的转录激活因子，由氧调节亚单位HIF-α和结构亚单位HIF-β (也称作ARNT)组成。两个单位都是基本螺旋一环一螺线(B-HLH)转录因子家族中的成员，并具有Per-ARNT-Sim(PAS)结构域。α亚单位的结构域包括一个独特的氧依赖降解结构域(ODDD)，这是正常氧分压下HIF-1降解所必需的结构，两个反式激活结构域(transaction domain，TAD)，主要参与转录激活作用，一个N末端活性域(NAD)和C末端活性域(CAD)，并且ODDD和NAD还有一部分重叠;β亚单位只包含一个TAD和一个CAD。

　　在HIFα家族中还包括HIF-2α和HIF-3α。HIF-2α和HIF-3α分别与HIF-1β组成HIF-2和HIF-3，其中HIF-2α，包含BHLH结构域、PAS结构域、TAD及入核信号[1]，是HIF-2活性的功能亚单位，受氧水平的调节。HIF-1α有很多变异体，它们的组成相似但是包含结构域的种类数量存在差异。HIF-3α发现了6个剪接变异体。2HIF-α的激活机制缺氧是激活HIF的主要信号，但是一些金属离子，例如Co2+、Ni2+、Mn2+也能通过螯合作用激活HIF，除此之外,HIF的激活信号还包括一些生长因子、细胞因子等。

　　2.1HIF-1α的降解

　　在正常氧状态下，HIF-1α的半衰期<5min，ODDD多肽序列内的保守性脯氨酸残基被羟化，进而通过包含von Hihhel D Lindau肿瘤抑制蛋白(pVHL)的E2泛素连接酶迅速靶向降解HIF-1α，有研究表明[2]实验条件下，可以根据HIF-αE3泛素连接酶靶向降解的原理来感知细胞内氧气含量的变化。

　　2.2HIF-1α转录的激活现已知调控HIF-1活性的信号途径主要为两条：PI-3K/Akt依赖的HIF-let蛋白稳定性调控和MEK/MAPK介导的HIF-1反式激活功能调控[3]。在HIF-1α的转录激活中，CAD起重要作用。高度保守的CAD结构域通过其富含亮氨酸的区域与共刺激分子p300(也称作CBP)的CH1结构相互作用达到激活作用。酪氨酸激酶M2(PKM2)是PKM2基因的产物，具有促进肿瘤生成的作用，PKM2基因的表达受HIF-1调控。Luo W等[4]的研究表明PKM2能够加强HIF-1的聚合和p300的募集，进而促进HIF-1靶向基因的激活。PKM2通过与脯氨酸羟化酶3(PHD3)的作用来加强其与HIF-1α的联合和共激活作用，质谱分析法和抗羟脯氨酸抗体试验表明在HIF-1靶向基因激活过程中PKM2的403/408脯氨酸位点发生羟基化，敲除PHD3抑制PKM2的共激活作用。REED1蛋白是PI-3K/Akt依赖的HIF-let蛋白稳定性调控中的一个重要因子，它在调控TOR复合体1(TORC1)的活性过程中具有重要作用。Horaka P等[5]阐明了一种依赖REDD1的HIF-1负反馈调节机制，这一负反馈环在抑制肿瘤过程中具有重要作用。体外实验表明REDD1基因的缺失导致HIF-1和其靶向基因表达的增加，而在体内具有致肿瘤性。进一步研究阐释REDD1缺失时细胞内活性氧(ROS)大量增加，ROS能够稳定HIF-1α，进而促进肿瘤的发生和生长，应用抗氧化剂能够抵消ROS导致的HIF-1水平的增加。HIF的激活需要很多个基因表达水平的上调，这些基因通过稳定HIF的活性或者提高HIF的表达水平来激活HIF，Partch CL等[6]通过核磁共振光谱分析技术发现HIF-α具有的ARNT PAS-B结构域提供了一个额外的结合位点，共激活剂(TACC3)通过与这个位点结合调节缺氧条件下HIF靶向基因的转录，同时实验还表明，这种ARNT PAS-B介导的HIF激活作用离不开HIF- TADs，详细的激活过程尚待进一步研究。

　　2.3HIF-2 的调节机制HIF-2 的调节机制与HIF-1 的调节机制相似，但也有其特点。Dioum EM等[7]的研究发现在培养的细胞和小鼠体内，降低或者提高Sirt1(一种能够在缺氧条件下选择性激活HIF-2α活性的乙酰基转移酶)的活性或者浓度会影响HIF-2α靶向基因，Sirt1能够像其他环境压力一样促进HIF-2α缺氧条件下的反应。另外，Koizume S等[8]在卵巢透明细胞癌CCC(ovarian clear cell carcinoma，CCC)研究中发现了HIF-2α一种不同寻常的调控转录激活方式。HIF-2α通过与Sp1相互作用而不是ARNT，以依赖于缺氧反应原件HRE(hypoxia-responsive element，HRE)的方式，协同组蛋白去乙酰化酶HDAC2，HDAC4作用在凝血因子VII的启动子上，诱导激活凝血因子VII，与此同时p300组蛋白乙酰基转移酶HAT(histone acetyltransferase，HAT)对此过程起到负调节作用，该分子机制解释了CCC在缺氧环境下仍然保持高度的凝血活性。这一成果对治疗CCC具有一定的指导意义。

　　3生物学功能

　　3.1HIF与实质性肿瘤HIF对于肿瘤的重要影响最先见于免疫组织学发现的研究结果，这个结果表明在原发恶性肿瘤和转移瘤中HIF表达很高。实质性肿瘤生长速度大于血管的生长速度，因此肿瘤内部逐渐形成了缺氧的环境，而HIF的高表达与肿瘤内部需要氧气含量感应和信号传导有关。同时，肿瘤诱导的基因突变也能够增强HIF的表达。肿瘤突变基因与HIF表达水平的关系最有说服力的证据当属VHL蛋白。VHL蛋白在HIF-1和HIF-2的蛋白酶体靶向降解中发挥重要作用，von Hippel-Lindau病是一种家族遗传性肿瘤综合征，患这种病的病人VHL蛋白与HIF-1结合受损。因此，HIF-1降解减少、含量增加，而病人患有血管、视网膜、小脑、肾上腺髓质和胰腺肿瘤的几率大大提高。经典的观点认为，实质性肿瘤内主要是HIF-1α高表达，但Franovic A等[9]的研究却发现：虽然在基因层面上癌症具有多样性，但却集中于一个共同的受控于HIF-2的生长轴。抑制HIF-2的表达，在体内能够阻止高恶性肿瘤如胶质母细胞瘤、直肠癌、肺非小细胞癌的形成和生长，在体外观察到肿瘤组织能够自发增殖，且不受突变状态和组织来源影响。进一步研究表明，HIF-2是通过表皮生长因子受体、胰岛素样生长因子受体和下游的细胞外信号调节激酶/苏氨酸激酶(ERK/Akt)等信号通路实现肿瘤增殖的调控作用，沉默这些受体，HIF-2的致癌性就消失了。HIF-1α和HIF-2α在肿瘤的高表达提示它们可能是治疗肿瘤的有效的靶点。通过肿瘤组织中HIF的靶向消除能够在一定程度上限制肿瘤的生长和转移，一般而言，HIF-1的表达与恶性肿瘤的发展和预后不良密切相关，但Huang X等[10]的研究结果显示在抑制肿瘤过程中HIF-1同样表达，如在缺乏HIF-1α时，能够促进来源于胚胎干细胞的畸胎瘤细胞和来源于小鼠星形胶质细胞的肿瘤细胞的生长。另外，HIF-1α还能够通过拮抗HIF-2α起到对肿瘤生长的抑制作用[11]。这一成果表明HIF-1α直接影响两种缺氧应答途径——其一是促进血管生成改变细胞代谢的途径，另一条与之作用相反是能够限制肿瘤初期生长的途径。随后，在研究乳腺癌MCF-7细胞时，Su K等[12]还发现，TNF-α诱导表达的HIF-1α可以反过来结合到VASP(vasodilator-stimulated phosphoprotein)启动子上，通过抑制其转录而起到抑制MCF-7细胞的粘附和增殖功能。进一步说明了HIF-1α的这一抑制肿瘤细胞生长的特性。然而更多的实验研究结果却与之相反，如Schwab LP等[13]首次发现HIF-1α可以通过Notch信号通路，调控靶基因Prominin-1(CD133)的表达，进而对肿瘤起始细胞(tumor-initiating cells，TICs)起到调控作用，该过程在促进初级肿瘤细胞生长及转移中起到了至关重要的作用。Zhang T等[14]在转移性膀胱癌研究中发现，T24-L细胞系(T24肺转移亚系)的强转移能力，与HIF-1α通过上调MMP-1水平有着密切的关系，而MMPS在许多癌细胞系已被证实，其含量的增加，能够加强癌细胞的转移能力。Zhou J等[15]还发现，在缺氧条件下，HIF-1α能够通过捆绑一个缺氧反应元件HRE到RhoE启动子上，能够在转录水平上上调RhoE。从而促进了胃癌细胞发生上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transitions，EMT)以及侵袭能力。因此，后一途径中HIF-1的这种抑制肿瘤细胞初期生长作用尚需要更多的实验研究，而其能够促进肿瘤细胞转移、增殖、侵袭上皮-间质转化以及肿瘤内血管再生，与肿瘤的不良预后呈正相关作用已被更多研究所证实，因而成为主流观点[16]。与此同时，HIF-2α的水平也不是越低越好，Mazumdar J等[17]的研究表明HIF-2α缺失会促进结直肠癌基因(KRAS)导致的肺部肿瘤的发展。在KrasG12D非小细胞肺癌(NSCLC)鼠模型中，分别敲除HIF-1α和HIF-2α，敲除HIF-2α的小鼠肿瘤生长受到促进，同时肿瘤抑制基因Scgb3a1表达减少，而在HIF-1α敲除的小鼠中没有出现类似情况。进一步研究表明Scgb3a1是HIF-2α的靶向基因，HIF-2α通过调控Scgb3a1来控制肿瘤的生长。HIF-2α的过表达会促进NSCLC的生长，因此降低HIF-2α的水平能够治疗NSCLC，但该实验表明当HIF-2α降低到一个限度后，会抑制抗肿瘤基因例如Scgb3a1的作用。因此,降低HIF-2α 来治疗NSCLC的方法有待进一步研究。

　　3.2HIF与血液肿瘤众多研究已经证明了HIF在实质性肿瘤发病机制中的作用。而其与血液恶性肿瘤例如多发性骨髓瘤中的关系也被发现。用5T2MM多发性骨髓瘤小鼠模型，Asosingh K等[18]的研究显示将正常小鼠和患有骨髓瘤的小鼠同时置于缺氧环境下后者的缺氧程度会比较轻，而且血管生成数量较之于前者更多。HIF-1在多种肿瘤中的高表达引起了人们高度的重视，HIF-1能够促进血管的生成，这为高速生长的肿瘤提供足够的氧气及养料供应。实验表明将HIF-1注射到免疫缺陷的小鼠体内能够使胚胎干细胞形成血管性质的畸胎瘤，反之，HIF-1部分敲除的小鼠肿瘤形成较小，且内皮生长因子(VEGF)的含量也降低[19]。

　　3.3HIF与肿瘤药物抵抗在乳头状癌(Invasive micropapillary carcinoma，IMPC)研究中，Doublier S等[20]通过用乳腺癌MCF-7细胞株三维培养，在形态学上来模拟IMPC细胞。他们发现在MCF-7细胞株中，HIF-1被激活并且参与了MDR-1基因(编码P-糖蛋白，Pgp)的转录控制，使得MCF-7细胞表面Pgp表达增加，因而使其聚集阿霉素(一种抗肿瘤药)能力以及对自身细胞毒素的敏感性均有所下降。另外，通过使用HIF-1 抑制剂，Pgp含量减少，MCF-7细胞内聚集的阿霉素上升。MCF-7三维培养的细胞株的这种通过HIF-1的激活作用使细胞膜上Pgp含量增加，因而使其获得对阿霉素的抵抗作用，有可能揭示出IMPC药物抵抗相似的分子机制。另外，Boucher Y在研究甲状腺癌药物抗性中发现，HIF-1下游靶标VEGF与药物抗性有着密切关系。阻断VEGF信号通路，能够促进肿瘤血管分布规范化，从而增加输送到肿瘤组织的药物含量。反之，加强VEGF信号通路，肿瘤血管趋于杂乱，功能异常甚至出现漏孔，因而造成该区域低灌注并阻碍药物扩散进入到肿瘤组织。Qayum N发现，阻断EGFR、 RAS和PI3K传导通路也同样有该效果。另外，作为HIF-1下游靶标的VEGF还可以反过来诱导HIF-1α，并促进HIF-1的激活，从而强化了肿瘤的药物抗性[21]。

　　3.4HIF与凋亡HIF在缺氧诱导凋亡中的作用比较复杂。一些调控细胞周期的基因如p21、p53的表达依赖于HIF[22,23]，抗凋亡基因Bcl-2在缺氧的条件下会下调[22]，同时促进凋亡的Nip3含量会上调[23]。因此，在HIF的作用下，长期的慢性缺氧会促进细胞的凋亡。但是，Sendoel A等[24]的研究却有不同的结果，结果显示HIF-1能够对抗DNA损伤诱导的胚细胞凋亡，这种凋亡是在CEP-1的作用下实现的，而CEP-1是p53的同族体。进一步研究表明，HIF-1的抗凋亡特性是通过上调酪氨酸酶家族成员TYR-2的转录水平实现的，TYR-2由ASJ感觉神经元分泌，具有对抗CEP-1依赖的细胞凋亡作用，实验表明敲除人类黑色素瘤细胞中的TRP2(TRY-2的一种同族体)会增加细胞凋亡。这一新近研究是否具有代表性尚需进一步实验验证，但是毋庸置疑的是HIF与细胞凋亡之间的关系还有许多细节不清楚。

　　3.5其他生物学功能一直以来HIF在肿瘤中的作用都是最受人们关注的，但是其在其他方面的生物学功能也不容忽视。近来Bento等人研究表明在糖尿病导致的各种缺氧条件下，HIF-1水平的不稳定极可能是促进高血糖症向糖尿病转化的重要因素[25]。HIF介导的转录反应能够降低机体获得氧气的能力。Peng YJ等[26]研究表明，在HIF-2α杂合子的成年小鼠中，颈动脉体对于缺氧、呼吸异常、窒息、高血压的反应敏感性大大增加，并且能够提高血浆中去甲肾上腺素的水平。进一步研究表明，HIF-1α并没有相同的作用，HIF-1α杂合的小鼠不会出现上述敏感性的增加，反之颈动脉体的敏感性会受到严重的损害。这些结果说明HIF-2α在维持颈动脉体敏感性上具有重要且独特的作用。在缺氧条件下雌激素受体 α(ER α)的水平会被下调，这种下调作用是通过蛋白酶体的降解实现的。Ryu K等[27]的研究表明在转录水平上，HIF-1α能够抑制雌激素受体1(ESR1)基因的转录，从而降低ERα的水平，而且这一途径与蛋白酶体的降解途径不相关。这说明HIF-1α可能与ESR1直接相关，或者HIF-1α通过某个转录产物间接的抑制ESR1的表达，具体是哪一种机制尚需要进一步的实验。HIF-1α在心肌缺血后的心肌保护中也有重要作用。这种心肌保护主要通过可诱导的一氧化氮合酶(iNOS)、血红素氧化酶1(HO-1)和红细胞生成素(EPO)对心肌损伤的缓解作用间接实现的。Belaidi E等[28]的研究表明，间歇性的缺氧能够缓解缺血后心肌的收缩障碍和细胞坏死，而这种间歇性缺氧正是HIF-1上调iNOS实现的。

　　4展望

　　现已得知,HIF可调控许多介导机体缺氧适应的靶基因,如红细胞生成素 (EPO)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)和糖酵解酶类等，其在肿瘤生理中作用更是不容忽视，但是随着转基因技术、组织特异性基因敲除技术及体内干扰实验等多项精细技术的发展和研究的深入，更多HIF的生物学功能将会被发现，例如近期Yang S等[29]和Saito T等[30]的两篇文章表明HIF-2α在实验条件下能够诱导小鼠产生骨关节炎，但毋庸置疑这一作用对于人来说，是否有相同的效应尚待研究。由此可见,HIF这一哺乳动物中相当古老保守的序列还有许多秘密尚待发现，而对于HIF的研究也能够为肿瘤、缺血性疾病的治疗提供理论依据。

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