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【关键词】 多囊肾病(PKD);多囊蛋白(PC);细胞外基质重构
多囊肾病(polycystic kidney disease，PKD)是一种与肾小管上皮细胞异常增殖，内含液体的囊泡形成与增大以及细胞外基质异常有关的疾病[1]。常染色体显性遗传PKD(autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD)的发病率介于1/1000～1/400，是最常见的一种PKD[2]，占我国终末期肾衰竭病因的第4位。至少有3种基因Pkd1、Pkd2、Pkd3突变可以引起ADPKD，其中85%是由Pkd1突变引起的。Pkd1基因表达产物为多囊蛋白-1(PC1)，目前认为PC1结构功能缺陷是肾囊泡发生和发展的主要原因。斑马鱼实验模型研究提示，与人类PKD基因高度同源的pkd1a/b和pkd2与调节细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的分泌和装配有关，从而改变基质完整性，这可能是ADPKD病变中的病理学基础之一[3]。以人类ADPKD肾为材料，采用标准EnVision免疫组织化学方法(又称ELPS法)的研究表明，PC1的异常表达可以引起多种细胞外基质的异常[4]。PC1具有特殊的胞外功能域，这些功能域被证明与多种细胞外基质组分有联系。近期研究者们综合应用多种方法研究细胞外基质与多囊肾病发展的关系，并试图通过调控细胞外基质的重构，抑制多囊肾病的病程发展，许多抑制细胞外基质重构的药物也应用于动物ADPKD模型中。 本文将从PC1结构和功能，PC1与细胞外基质的联系，细胞外基质与ADPKD发展的相互影响和通过影响ECM重构而在ADPKD病程发展中起抑制作用的药物几方面介绍细胞外基质与多囊肾病的发生发展之间的关系。
1 多囊蛋白1(PC1)
1.1 PKD基因
将斑马鱼的PKD1同源基因pkd1a&b敲除引起背轴弯曲、脑积水、软骨和颅侧缺陷，前肾低频率(10%～15%)的囊泡形成。在敲除PKD2基因的个体中则重点表现为背轴异常弯曲。研究提示ipkd1a/b和pkd2与调节ECM分泌和装配有关，从而改变基质完整性，这可能是ADPKD病变中的基础缺陷之一[3]。
1.2 PC1的结构与功能
PC1功能域中包括位于N端附近的两个富含亮氨酸的重复序列(LRR)，其两端分别为富含半胱氨酸和羧基区域，合称flank-LRR-flank。flank-LRR-flank排列与蛋白质-蛋白质间联系密切相关[5]。还包括一个糖基化的C型凝集素功能域。15个Ig样重复序列连续排列于C型凝集素功能域C端，另外一个Ig样重复序列则位于C型凝集素功能域N端一侧。紧接着15个Ig样片段C端处的是4个纤连蛋白3型相关序列。此外，发现在凝集素和Ig样重复之间存在一个富含半胱氨酸的，低密度的脂蛋白A功能域[6]。在正常情况下，这些功能域排列于细胞外并且参与细胞-细胞或细胞-基质间联系。
2 PC1与ECM的联系
2.1 PC1与信号转导
近期研究显示ADPKD肾中的失去极性的上皮细胞可以异常表达上皮生长因子受体和具有Na+-K+-ATP酶活性的膜蛋白[7]。这种异常表达是由于胚胎基因ErbB2和Na+-K+-ATP酶β-2亚基基因没有正常关闭所致。有学者提出一种可能的模型，认为PC1参与了上述基因的表达调控[8]。根据这个模型，正常情况下，PC1通过与细胞外成分结合而获取信息，并通过其C端磷酸化信号传导调控基因转录。在ADPKD细胞中缺乏这种信号级联反应，引起基因转录异常导致肾的异常发育。在PC1与基质配体，比如整合素簇和粘着斑复合体结合后，这些配体被酪氨酸蛋白激酶如粘着斑激酶和Src磷酸化而产生活性，进一步引起下游的级联反应影响活性基因调控蛋白(active gene regulatory protein,AP-1)依赖型基因的转录[9]。除了通过调控AP-1依赖型基因的转录，PC1还被发现能通过wnt通路调节TCF依赖型基因的转录。PC1抑制中间转导物糖原合酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)的磷酸化，从而导致β-连环蛋白的稳定性增加而积聚，β-连环蛋白又可以与转录因子TCF结合成为复合体，从而激活TCF反应性基因的转录[10](见图1)。图1 PC1通过c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)途径调节AP-1类基因的表达以及通过Wnt途径调节TCF反应性基因的表达哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白简称mTOR，此通路在正常情况下被抑制，在ADPKD中则被激活，mTOR影响胶原蛋白的合成与稳定,并与TGF-β和αvβ3整合素信号通路相互作用,影响细胞外基质的产生。PC1可以调节mTOR和转录因子STAT6通路。薯球蛋白是结节性硬化基因-2(tuberous sclerosis2,TSC2)的编码产物，是mTOR途径中的重要调节因子。mTOR活性依赖于小片段G蛋白的GTP结合状态，薯球蛋白通过其GAP功能域调节这些小片段的GTP/GAP状态发挥功能。GAP有活性的前提是与错构素(一种PKD1编码产物)结合形成复合物，这种薯球蛋白-错构素复合物在正常情况下抑制mTOR[11，12]。ADPKD中PKD1的突变或缺失导致薯球蛋白呈游离状态，并可以作为Akt和RSK1等激酶的底物而激活mTOR。这又会引起上皮细胞对生长因子的敏感度上升而激活PI3K或Erk通路。EGF受体信号导致的Erk激活已经在多种人类和动物的囊化性疾病中有所记录[13]。
2.2 PC1与细胞外基质组分的关系
有学者提出PC1作为细胞外基质受体通过粘着斑蛋白联系ECM与肌动蛋白细胞骨架。免疫共定位和免疫共沉淀结果表明在正常胚胎肾和亚融合上皮细胞培养中，PC1与α2β1整合素、踝蛋白(talin)、纽带蛋白(vinculin)、桩蛋白(paxillin)、P130cas、粘着斑激酶和c-src形成多蛋白复合物。在正常成人肾和融合上皮培养中，PC1表达下调并与E-钙粘素和β、γ、α-连环蛋白形成细胞之间连接。抑制酪氨酸磷酸化和细胞内钙离子浓度上升引起PC1-黏着斑蛋白复合物相对于细胞间连接复合物增多[10]。用酪氨酸磷酸化抑制剂处理细胞后，PC1与FAK的联系被切断，同时PC1与β-连环蛋白连接，提示PC1通过酪氨酸磷酸化而调节细胞分化[14]。在发育和突变的过程中，PC1的分布由细胞-基质粘合转向细胞间连接。提示PC1可能以此方式调控细胞分化。从结构上讲，除了PC1 N端富含半胱氨酸的区段被发现与多种粘着斑蛋白有关联。对PC1Ig样功能域序列10的核磁共振结构分析表明，从人类到河豚中均有一个Ig样β折叠也可以与细胞外基质结合[15]。此外，PC1最末端的1000AA序列与海胆卵胶受体有高度同源性，其功能不清。近期，海胆卵胶受体(REJ)家族的其他成员在人类睾丸中被发现[16]。尽管PC1中此功能域的作用尚不清楚，但在海胆中它与精卵接触后，钙离子流入从而改变精子膜结构以受精中起到作用。可能在PC1中此结构也有类似的介导钙离子流入的功能。钙离子浓度的变化又可以调节多种下游级联反应的发生与程度，从而调节细胞的增殖和分化。ADPKD细胞中，细胞内钙离子浓度降低也是其过度增殖和低分化产生的原因之一。
3 多囊蛋白-2(PC2)与细胞外基质
多囊蛋白-2(PC2)是定位于4q12～22的另一种多囊肾基因PKD2的编码产物。尽管PC2结构中有多个功能域与PC1同源，但与PC1不同的是，PC2的N端和C端都位于细胞内。尽管人们对PC2的结构还不是很清楚，但人们假定PC2的C端存在一个特殊的盘绕的功能域，PC2通过此功能域与PC1相连[17]。在PC2的C端发现了一个EF手样的基序。EF手样基序包含多个钙离子结合位点并，并可能以单体或多体形式存在并根据其结构不同，发挥催化酶促反应或调解细胞内钙离子水平的作用。另外，Tsiokas L等在1999年发现PC2和与果蝇基因TRPC同源基因编码的钙离子流入通道相连[18]，这种表达产物在哺乳动物表现为一种非选择性的，钙离子可渗透的阳离子通道，允许钙离子流入细胞。对PC2功能的理解不像PC1那么深入。除了与PC1共同形成复合体调节细胞内钙离子水平以外，近期的多项研究表明，除了与PC1相关的功能，PC2本身也有许多作用。比如关于信号转导的研究发现，PC2可以像PC1一样，激活AP-1依赖型基因的转录。与PC1不同的是，它不仅可以通过 c-Jun 终端激酶途径达到此功能，也可以通过丝裂原激活的蛋白激酶途径。后一种途径可以被钙离子非依赖性的PKC调控[19]。另外，PC2被发现与Hax2,一种与肌动蛋白细胞骨架相连的蛋白质有联系[20]。这些都提示PC2可能通过调控蛋白质合成等方式与ECM联系，但对PC2的结构功能还需要更多的研究。
4 细胞外基质和ADPKD发展的相互影响
4.1 细胞外基质重构
ECM发生重构是ADPKD发展的标志性改变之一。ECM调节细胞的增殖与分化可能是通过直接作用和间接作用。多数构成ECM成分的分子结构中均有促进细胞分裂的EGF样功能区。在正常情况下，ECM的EGF功能区遮蔽，在创伤后被暴露，刺激细胞分裂。体外实验证明：层连蛋白LN的EGF样结构能促进成纤维细胞和表皮细胞的增殖。一些ECM分子如珍珠素和修饰素能与细胞因子结合，不仅具有贮存细胞因子的作用，而且有调节这些细胞因子活性的作用，从而间接调节细胞的增殖和分化。Candiano等发现在富含一型胶原的培养基中培养的MDCK细胞形成囊泡，提示细胞外基质中的某些胶原成分可能与囊泡形成发展有密切联系[21]。另一方面，随着ADPKD的发展，囊泡中液体不断渗出，体积增大。随着囊泡生长和液体堆积，相连的细胞外基质开始进行重构。在单层培养的MDCK细胞中，牵拉细胞膜下的支持物可以引起细胞增殖。此外，上皮细胞表面的初级纤毛也通过调节某些基质蛋白的表达而参与此过程。肾的纤毛是由微管构成的，黏着于小管和集合管膜表面的突出物。它被报道可以对细胞内上升的钙离子流入感应并反应[22]。许多研究表明PC1和PC2位于初级纤毛，并可以作为短暂的有通道潜力的受体，感受并调节细胞内钙离子浓度。纤毛弯曲引起钙离子通过PC2的通道流入细胞内[23]。这种感知能力在PC1突变的细胞中消失了。许多PKD有关的细胞功能，比如包括基质蛋白基因在内的基因表达，细胞周期，分化与凋亡，都被细胞内钙离子浓度所调节。纤毛的功能异常与细胞周期的持续进行有很大关系。PC1通过上调p21激活JAK-STAT途径，导致细胞周期停滞于G0/G1[24]。纤毛上的IFT88/POLARIS蛋白被证明与细胞周期过渡中中心体密切相关。它的过度表达可以阻止G1/S过渡并诱导细胞凋亡。相反，其表达缺失则引起细胞周期持续进行[25]。PC2同样可以通过与Id2，一种螺旋-环-螺旋家族蛋白(可调控细胞增殖分化)的连接而调节细胞周期。在PC结构被描述之前，人们就假定细胞基底膜连接的改变可能是PKD的主要病变。现在有充分的证据证明在多数ADPKD中，基本的缺陷在于细胞-细胞/基质连接蛋白。小管上皮细胞和ECM具有相反的序列以相互连接。ECM与细胞之间的联系被破坏可以引起细胞异常分化，就像ADPKD中的异常分化。PC在细胞-基质连接中起到重要作用并可能直接于ECM组分相连，通过胞质区介导上皮细胞通讯[26]。
4.2 细胞外基质/血管硬化
近期，基质血管硬化也被证明与包括ADPKD在内的慢性肾病(chronic kidney disease，CKD)有密切关系，成为一个新的研究热点。CKD病人的血管钙化率比同年龄组的血管造影术确诊患有冠状动脉疾病的患者高2～5倍。在CKD中基质血管硬化的病理机制尚未被完全弄清，但有一些实验结果可以提示一些相关的危险因素。在CDK中，电解质代谢异常，骨营养不良可能和血管钙化有关，大多数CKD患者的副甲状腺激素和磷的水平都比一般人高。用磷酸盐结合剂抑制胃肠道吸收磷并用维生素D抑制副甲状腺激素的分泌，刚开始，病人表现为低血钙，但再给予钙离子后，又表现出高血钙[27]。用不含钙的磷酸盐结合剂治疗CKD小鼠与含钙的磷酸盐结合剂相比可以降低动脉钙化，提示在CKD引起血管钙化的过程中，钙离子的过度摄入可能是一个重要病理机制。在动脉钙化的过程中，一个基本基质便是血管平滑肌(VSMCs)向成骨细胞分化，而这一分化过程可能是通过上调核结合因子α-1(Cbfa1)的表达而实现的，因为缺失Cbfa1的小鼠表现为不能实现骨矿化[28]。在从进行肾透析的CKD病人获得的上腹部动脉的组织学切片中，研究组发现了Cbfa1和多种骨相关蛋白(骨桥蛋白、骨唾液酸糖蛋白、碱性磷酸酶和一型胶原)的表达[29]，提示这也可能是CKD病人发生基质血管硬化的基质之一。
4.3 细胞外基质的炎症反应和纤维化
有越来越多的证据表明，间质炎症反应和纤维化在CKD肾功能损伤中起到重要作用。炎症反应和间质纤维化压迫束紧了肾小管和小管周围的毛细血管，导致其发生萎缩并与相应肾小球分离。同时，肾小管与毛细血管的间隔扩大，氧的扩散变得愈发艰难，最终导致组织缺氧受损，而缺氧又进一步刺激炎症介质的产生，肌成纤维细胞聚集和胶原沉积[30]。此外，炎症细胞的聚集还可以通过破坏肾小球血管对于系统性高血压的自动调节基质而引起其损伤。有研究发现，小管间质内炎症细胞聚集与肾小球入球小动脉发生增殖性表型有关，导致ECM的重构并降低血管平滑肌对于收缩性刺激的反应。随着慢性肾病的发展，肾小球滤过屏障受损，导致蛋白尿。蛋白尿不仅是肾小球病变引起的一种症状，反过来也可以成为非糖尿病性慢性肾病进展的一个独立危险因素。近年来研究提示尿蛋白在经过肾小管时，可通过直接毒性作用和激活补体两种方式导致肾小管间质纤维化。尿中的白蛋白被近端小管上皮摄入后，可产生活性氧分子激活NF-κB，后者作为转录因子调控包括TGF-β1、IL-8、趋化因子等炎症细胞因子的表达。蛋白尿性肾病的患者和小鼠肾小管刷状缘有C3和C5b-9沉积，提示蛋白尿与补体激活相关[31]。研究显示，C3裂解产物C3a不仅可以促进炎症细胞的聚集，还可以与通过小管上皮表面受体直接作用，上调一型胶原蛋白表达而促进纤维化。而C5b-9具有上调小管细胞内四型胶原蛋白表达和促进肌成纤维细胞向小管聚集的作用[32]。
5 以细胞外基质重构为作用靶点的药物
5.1 基质金属蛋白酶(matrix metallo proteinases，MMPs)抑制剂
MMPs是一类在细胞外基质成分重构和溶解多种细胞表面蛋白质中起到重要作用的蛋白酶大家族。MMPs是一种锌依赖的蛋白酶家族，可以分解多种细胞外基质组分，同时促进细胞增殖迁移。在正常组织中，MMPs表达量很少;但当发生组织损伤时，其表达量可以大幅上升。在发生进行性病变肾组织中，MMPs可能对胶原-整合素联系起到调节作用，从而产生对肾基底膜重构起关键作用的蛋白溶解过程[33]。有许多研究结果表明MMPs通过调节基质蛋白的合成分解促进多囊肾病的发展：从C57BL/6J-cpk鼠身上取得的肾小管含有比正常鼠更高水平的MMP-2和-9[34]。PKD病人血清中MMP-1、-9和金属蛋白酶抑制剂-1的水平显著高于健康人。MMP-14mRNA在Han:SPRD大鼠囊化的上皮和远端小管高表达。在急性缺血性肾衰竭(IRI)和输尿管损伤中均出现细胞外基质积聚的现象。基质金属蛋白酶被证明与肾IRI和ADPKD病变有关。用MMP抑制剂巴马司他处理Han:SPRD-cy/+大鼠可以显著减少囊泡数量和肾重量[35]，提示MMP抑制剂 可能是PKD的有潜力治疗方法。
5.2 胶原抑制剂
胶原基因在胚胎初始阶段高度表达，待组织形成后表达关闭。缺乏多囊蛋白PC1和/或PC2，胚胎期的基因表达不能适当地关闭。PC缺陷的斑马鱼症状可以被多种胶原生成或交联抑制剂所缓解。氨酰氧化酶抑制剂MCP和βAPN在斑马鱼胚胎可以抑制胶原交联。PI3K抑制剂渥曼青霉素和LY294002溶解于DMSO对斑马鱼胚胎脊索col2a1(一种胶原合成基因)基因表达起到抑制作用[10]。
5.3 雷帕霉素
研究表明，雷帕霉素作为一种mTOR通路抑制剂可以延缓Han:SPRD小鼠的囊泡生长[36]。其主要作用原理是抑制了mTOR通路关键因子S6K的磷酸化而使之失活。雷帕霉素是一种有抗增殖和抑生长作用的免疫抑制剂，临床上用于预防同种异型排斥反应。
5.4 免疫抑制剂
细胞外基质的炎症反应和纤维化在肾功能缺陷进程中起到重要作用。免疫抑制剂可以通过抑制炎性因子的产生和作用而起到减缓ADPKD进程的作用。例如甲基泼尼松龙可以起到抑制pcy小鼠和Hart：SPRD大鼠的ADPKD进程，包括抑制囊泡扩大，抑制间质纤维化和保护肾功能的作用[37]。
6 总结
ADPKD是一种进行性慢性肾病，终末期导致肾功能衰竭。现今，ADPKD的治疗仅限于透析和移植。在ADPKD发病机制中，起重要作用的是多囊蛋白-1，而PC1与细胞外基质之间关系密切。基于对细胞质基质和多囊肾病发展相互关系的理解，为今后研究治疗PKD药物提供了新的药物作用靶点。
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