心脏毒素致小鼠肌损伤的组织形态学观察

【摘要】  目的建立由心脏毒素所致的小鼠肌损伤模型并对其进行形态学观察,为进一步研究肌肉变性疾病的发病机制和治疗方法提供参考依据。方法取C57小鼠12只，随机分为6组，将心脏毒素按5μg/只局部注入C57小鼠股四头肌中,于注射后1、4天和1、2、4、6周处死小鼠，分离股四头肌，取材行HE染色。结果注射1天后可见肌细胞变性坏死;1周后坏死加重，出现空泡，吞噬细胞包裹;2周后肌细胞变性坏死加重;4周后变性坏死钙化依然存在,但已可见部分肌纤维再生;6周后变性坏死已不明显,钙化仍存在,肌细胞部分再生。结论成功地建立了心脏毒素所致的肌损伤模型，为研究肌肉变性疾病提供了理论基础。

【关键词】  心脏毒素;肌损伤

　　骨骼肌占成人体重的40%~50%。研究肌损伤的物质基础是建立一种稳定简便的肌损伤模型。过去认为，造成肌肉组织损伤 包括机械性、物理性和化学性肌损伤等。由于这些方法不容易控制、相对复杂和重复性差而难以达到试验要求。进行性肌营养不良(DMD)是一种X-连锁隐性遗传性肌病，起病始于儿童早期，四肢近端无力及萎缩。病人在后期直至死亡的时期内主要是股四头肌、眼外肌和膈肌受累。建立眼外肌与膈肌损伤模型相对比较困难，而且需要考虑的因素很多，股四头肌损伤模型比较简便且容易控制。为此笔者做以下实验。

　　1实验材料

　　心脏毒素(Sigma),无菌剪刀，75%酒精，甲醛溶液，二甲苯等。

　　2实验动物

　　4~6周龄清洁级C57BL/6小鼠(15~17g)，雄性，由中国科学院上海实验动物中心提供。饲养于四川大学华西医学中心公共卫生学院IVC动物室并带有空气过滤装置和置于层流柜内的塑料笼内。笼具、垫料、饲料、饮水均高压消毒，饮水中加入抗生素：苯唑西林钠1g/L，盐酸环丙沙星0.25g/L，庆大霉素8万单位。

　　参照文献[1，2]，选取C57小鼠，4～6周龄，称重，

　　3实验方法

　　股四头肌处鼠毛75%酒精皮肤消毒，随机分为6组，1～6组左侧股四头肌局部注射心脏毒素5μg/只，右侧为对照，分别在注射后1天，4天、1周、2周、4周、6周颈椎脱臼处死小鼠，完整分离出股四头肌,去除筋膜、脂肪、神经等。浸入4%甲醛溶液中固定，常规病理包埋切片染色。

　　4结果

　　HE染色观察肌肉损伤的病理变化。正常肌纤维在光镜下呈细长形，肌细胞核为扁椭圆形，每个肌纤维有许多细胞核，位于肌纤维的周边，紧靠肌膜的内表面(图1)。注射心脏毒素后1天可见肌细胞变性坏死，细胞溶解，肌细胞核聚集(图2-A);4天后肌纤维发生明显断裂，肌细胞变细、变小，变性坏死加重，脂肪化、纤维化明显;1周后坏死严重，出现空泡，网状，吞噬细胞包裹并出现钙化，肌细胞胞体部分形成网状结构(图2-B);2周后可见肌细胞坏死加重达到顶峰，可见嗜碱性组织，巨噬细胞包裹吞噬坏死的肌细胞(图2-C);4周后变性坏死钙化依然存在，但已可见部分肌纤维再生(图2-D);6周后变性坏死已不明显，钙化仍存在，肌细胞部分再生(图2-E)。与张勇等[3]的结果基本符合。

　　5讨论

　　肌损伤研究的基础是建立一种稳定简便的肌损伤模型。造成肌肉组织损伤方法有多种，包括机械、物理和化学损伤等，但这些方法不容易控制，相对复杂，重复性差，难以达到实验要求。心脏毒素是从眼镜蛇毒腺中提取的一种毒素，文献报道注入小鼠骨骼肌后30 min 即可引起肌肉组织的坏死，光镜下可见损伤区域肌膜断裂，肌纤维挛缩，电镜下可见线粒体损害等病理改变，这是其造成肌膜和肌纤维的快速溶解所致。24h后可见肌细胞胞浆中出现“空袋”，仅包含有残存的肌纤维和肿胀的线粒体。心脏毒素致使肌肉组织损伤的机制是使骨骼肌发生坏死，诱导毛细血管通透性增加和组胺的释放。心脏毒素致肌肉损伤模型的优点：稳定、简便、易控制且重复性好;它克服了单纯的机械性或者物理性损伤模型难以控制且重复性不好的缺点。本实验在注射心脏毒素后的不同时间后，进行的组织学分析结果，与文献[3~5]报道基本一致。肌肉在损伤后经历了变性、瘢痕形成、损伤修复再生的过程。通过组织形态学的观察，为进一步认识肌肉再生的分子机制，以及在肌肉生长过程中，某些外源性因素对肌肉中某些蛋白质表达的影响，为进一步研究某些肌肉变性疾病如进行性肌营养不良(DMD)的分子机制提供参考依据。(本文彩图见封三)

【参考文献】
  　　1Andres V, Walsh K. Myogenin expression, cell cycle withdrawal, and phenotypic ifferentiation are temporally separable events that precede cell fusion upon myogenesis. J Cell Biol,1996, 132(4):657-666.

　　2Ownby CL, Fletcher JE, Colberg TR. Cardiotoxin 1 from cobra (Naja naja atra) venom causes necrosis of skeletal muscle in vivo. Toxicon 1993, 31(6):697-709.

　　3张勇,邹仲敏,郭朝华,等. 肌损伤的形态学观察.第三军医大学学报,2003, 25(14):1302-1304.

　　4Fletcher J E, Hubert M, Wieland SJ, et al. Similarities and differences in mechanisms of cardiotoxins, melittin and other myotoxins. Toxicon,1996, 34(11-12):1301-1313.

　　5Letcher JE, Tripolitis L, Beech J. Species difference in modulation of calcium release by Naja naja kaouthia snake venom cardiotoxin in terminal cisternae from human and equine skeletal muscle. Toxicon,1993, 31(1):43-51.