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关键词：吲哚青绿
【摘要】 目的 研究染色剂吲哚青绿（indocyanine green，ICG）在不同浓度和作用时间对视网膜各层结构的影响。方法 应用0.05mg/ml、0.5mg/ml ICG作用于新鲜尸体眼视网膜3、15、30min后对比观察ICG对视网膜各层次的形态影响。以同等量、相同作用时间的乳酸林格氏液替代ICG作为正常对照。结果 光镜显示，虽然0.05mg/ml ICG作用尸眼3、15、30min，视网膜各层次形态在光镜下未显示有明显影响，但在电镜下，随ICG接触时间延长，视网膜各层超微结构出现不同程度损伤。在光镜下0.5mg/ml ICG作用3min组与对照组相比，无明显结构改变。作用15min组显示部分视网膜内界膜一端自视网膜水平游离，作用30min组显示内界膜消失。相应的0.5mg/ml ICG作用15min后，电镜下可见节细胞溶解消失，作用30min组显示各层细胞结构异常，内界膜脱离，而对照组视网膜相对完整。结论 ICG对视网膜的毒性与ICG的浓度和作用时间相关。一定浓度ICG作用视网膜一定时间后可导致内界膜自动脱离，并对视网膜结构造成不同程度的破坏，临床上应谨慎应用。
关键词 吲哚青绿 视网膜结构 内界膜
The effect of indocyanine green on retinal structure
Wang Wenying，Zhang Xi，Wang Fang，et al.
Shanghai First People’s Hospital，Shanghai20000.
【Abstract】 Objective To study the effect of dyestuff ICG of different concentration on retinal structure at difˉferent period.Methods Applied0.05mg/ml，0.5mg/ml ICG on fresh cadaveric eyes for3，15，30minutes，to comˉpare the morphological structural changes of the different layer of retina.Results With0.05mg/ml ICG，the retina didn’t show significant changes under light microscope whileunder electron microscope it shows ultrastructural differˉent degree damages correlate with the time they meet.With0.5mg/ml ICG，the inner limiting membrane（ILM）deˉtached from one side of the inner retina at15minutes and totally disappeared at30minutes under light microscope.Correspondingly，the ganglion cells lost its’axon at15minutes and the retina shows completely disorganization，ILM detachment at30minutes under electron microscope while in the control group the retina is comparatively integrity.Conclusion Toxicity of ICG is depended on the concentration of solution and duration of its contact with organ.ICG at certain concentration make the ILM automatically detach from the retina，but it may destroythe construction of difˉferent layer of the retina at the same time，so it should be used cautiously in clinic.
Key words indocyanine green retinal structureinner limiting membrane
ICG于1957年引入临床并得到广泛应用 ［1］ 。在实行玻璃体切割手术治疗特发性黄斑裂孔与黄斑前膜等疾病时，应用ICG染色可提高手术中异常透明组织和牵引组织的可视性，辅助剥离视网膜内界膜（inner retinal limiting memˉbrane，ILM），以便彻底解除解剖学上的牵引，恢复视网膜的正常形态。虽然以往研究证实ICG静脉内毒性很小 ［2］ ，但其直接应用于玻璃体腔时，对眼组织，特别是神经视网膜有无毒性尚不十分清楚。近年发现ICG在800nm红外波段显示高吸收峰，可生成氧自由基并在光（包括手术光源）激活后进一步形成脂质过氧化物 ［3］ ，在玻璃体手术中对眼部正常组织存在潜在的毒性 ［4］ 。本实验旨在从形态学上观察不同浓度和不同作用时间的ICG对视网膜结构的影响。
1 材料与方法
1.1 材料 角膜移植后的新鲜尸体眼（青年男性，共4例，7只眼。一眼设为对照。）
1.2 尸体眼的石蜡切片制备和光学显微镜观察 用湿纱布环形固定，弃去眼前节组织，完全清除玻璃体，制成眼杯。0.05mg/ml、0.5mg/ml ICG于眼杯内放置3、15、30min。以黄斑部为中心，剪下5mm直径的视网膜，立即置于眼球固定液中，固定24h，作常规石蜡包埋，切片，HE染色，光学显微镜下观察。以0.1M PBS替代吲哚青绿作为正常对照。
1.3 ICG处理后尸体眼透射电镜标本的制备 同前处理的视网膜（7眼）置于电镜固定液中，经系列乙醇脱水，包埋，固化，LKB-型超薄切片机切片50～60nm，3%醋酸铀-枸橼酸铅双重染色，JEM-1200EX（JAPAN）透射电镜下观察，照相。
2 结果
2.1 ICG处理后尸体眼光学显微镜下的观察 0.05mg/ml ICG作用尸体眼3、15、30min，视网膜各层次形态在光镜下未显示有明显改变（图1）。0.5mg/ml ICG作用3min组与对照组相比，无明显结构改变。作用15min组显示部分视网膜内界膜一端自视网膜水平游离（图2）。作用30min组显示大部分视网膜内界膜消失，网膜结构异常，而对照组视网膜相对完整。
2.2 ICG处理后尸体眼透射电镜观察 电镜下所有眼超微结构上均显示有死亡后轻度的自溶反应。但对照组的视网膜内界膜在电镜下清晰连续，视细胞形态大致正常，内节核层未见明显异常（图3）。0.05mg/ml ICG处理30min组和0.5mg/ml ICG处理10min组显示少量神经节细胞和双极细胞呈空泡状，ILM与M ller细胞正常，外层视细胞大致正常（图4）。0.5mg/ml ICG处理15min组，所有节细胞轴突缺失，M ller细胞基质颜色加深，提示细胞变性（图5）。双极细胞较对照组肿胀明显，细胞内线粒体颜色加深，提示代谢障碍（图6）。本组部分双极细胞呈坏死状，内界膜自视网膜脱离，脱离的内界膜呈折叠状。与内界膜分离的M ller膜呈不规则锯齿状。0.5mg/ml ICG处理30min组显示内界膜完全脱离。各层细胞严重受损，细胞破裂，M ller细胞膜片段和细胞碎片黏附于ILM的视网膜面（图7）。
3 讨论
视网膜内界膜位于视网膜与玻璃体之间，相当于视网膜内层的一层屏障。应用三重染色法染色ILM象胶原一样被染成兰色。它与角膜后弹力层和脉络膜玻璃膜相似，随年龄增长而增厚，可形成局限性的隆起。吲哚青绿（又称靛青绿）带有负电核，呈水溶性。它选择性结合于视网膜内界膜，有利于玻璃体手术中明确拟剥除膜的范围。本实验以新鲜尸体眼为研究对象，观察不同浓度和作用时间下ICG对视网膜内界膜及视网膜各层结构的影响。与对照组相比，ICG处理组的尸体眼视网膜，呈现出不同程度的形态破坏。而且，此种形态改变与ICG的浓度和作用时间相关，提示ICG对视网膜各层结构有不同程度的毒性作用。0.5mg/ml ICG处理15min后，光学显微镜下可见内界膜自动从视网膜内层脱离。此外，在一定浓度ICG作用一定时间后，视网膜自内向外各层细胞出现不同程度的细胞超微结构损伤，包括神经细胞轴突缺失，细胞边界出现囊腔，细胞内线粒体颜色改变，细胞变性、破裂。被破坏的M ller’s细胞膜片段和细胞碎片黏附于ILM的视网膜面。ILM的完整性在处理组和对照组有明显差异，随与ICG接触时间延长，视网膜自内而外损伤逐渐加重，说明视网膜的损伤与它和ICG的接触时间有关。虽然在本实验中，ICG对视网膜的普遍性损伤可能与死后组织对外界刺激抵抗力差，易受损伤有一定关系，但对照组视网膜结构的相对完整性从另一方面证实和肯定了ICG的视网膜毒性。临床上，在ICG注入前，用气体填充玻璃体腔，可减低ICG在手术中的使用浓度，而完成膜剥离后充分彻底的冲洗，可减少ICG在眼内的残留，因此以往ICG辅助的内界膜剥离术后生物显微镜等检查未发现患者视网膜各层次结构的损伤。但有学者报道，ICG使用术后部分患者出现微小的视野缺损 ［4］ ， 可能仍与ICG对视网膜的毒性有关。
此外，黄斑位于视网膜后极部，呈椭圆形，横径5mm。中心凹部与周边视网膜相比较薄，只有一层外核层，缺少神经纤维层，神经节细胞层，内丛状层，内核层等结构。因此，在黄斑裂孔手术中，ICG容易在局部积聚，并可能进入视网膜下，直接与视网膜色素上皮细胞接触，使ICG与视网膜作用时间延长。Joussen证实ICG单独使用，在≥5mg/ml（60min）时对晶体上皮细胞产生毒性作用。而联合激光，ICG在0.01mg/ml（10min）即可引起细胞损伤，在照射2天后细胞坏死，自培养皿上脱落 ［6］ ，示联合激光使用可能使视网膜细胞对ICG的耐受力降低。也有研究表明，ICG作用后视网膜细胞功能受损，但HE染色和电镜检测在组织学和超微结构上未见明显异常 ［7］ 。不同的研究结果可能与实验用ICG的浓度不同有关。本实验结果证明低浓度的ICG毒性也较低，但浓度降低后ICG的染色效果也随之降低。更多系统的