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【摘要】 目的 建立一种高效液相色谱测定兔眼房水中氧氟沙星浓度的分析方法。方法 使用Kromasil C18色谱柱。流动相为乙腈:1.6%醋酸溶液（内含70mmol/L三乙胺）=38∶62，荧光检测器激发波长为290nm、发射波长为500nm，内标物为吡哌酸。结果 氧氟沙星最低检出浓度为10ng/ml。日内及日间RSD为2.16%～4.24%，4.38%～5.43%。回收率为>85%。结论本方法具有灵敏、准确、快速等特点。
关键词 氧氟沙星 兔眼房水 高效液相色谱 荧光检测器
Determination of ofloxacin in aqueous humor of rabbit by high performance liquid chromatography with fluorescence detection
Sun Lin，Kong Wei，Shan Li，et al.
Experiment Technology Centre，China Medical University，Shenyang110001.
【Abstract】 Objective A simple HPLC assaywas evaluated for analysis of ofloxacin in rabbit aqueous humor.Methods The mobile phase contained acetonitrile（38%）and1.6%acetic acid（containing triethylamine70mmol/L）（62%）and Kromasil C18column.Chromatograms were monitored with a fluorescence detector at290nm（excitaˉtion）and500nm（emission）.Results The limit of detection of ofloxacin in rabbit aqueous humor was10ng/ml.The intraday RSD was2.16%～4.24%.The interday RSD was4.38%～5.43%.The recovery was>85%.Conclusion The method is rapid，sensitive and accurate.
Key words ofloxacin rabbit aqueous humor HPLC fluorescence detection
氧氟沙星是一种氟喹诺酮类的高效广谱抗菌药，对多种革兰阳性菌和革兰阴性菌具有较强的抗菌活性，其半衰期长、毒性轻微，临床上广泛应用 ［1～3］ 。国内外有关氧氟沙星的测定方法中用紫外检测和测定的样品为血清、血浆、尿 ［4～6］ 。本文采用反相高效液相色谱，用甲醇沉淀蛋白后直接进样，利用荧光检测器测定兔眼房水中氧氟沙星含量，具有灵敏高、简便、准确等特点，为氧氟沙星的药动力学和药效学的研究提供一种可适用于常规检测的方法。
1 仪器和试剂
1.1 仪器 Waters6000A泵，Millennium32工作站，464型荧光检测器，U6K进样器。
1.2 试剂 氧氟沙星标准品（中国药品生物制品检定所），对照品为泰利比妥（日本参天制药株式会社）。吡哌酸为Sigma试剂。乙腈、甲醇为色谱纯。冰醋酸、醋酸钠、三乙胺、氢氧化钾等均为分析纯。
2 实验方法
2.1 色谱条件 色谱柱:Kromasil C18（5μm，4.6×300mm）。流动相:乙腈∶1.6%醋酸溶液（内含三乙胺70mmol/L）=38∶62。流速为0.6ml/min。荧光检测器激发波长为290nm，发射波长为500nm。柱温为室温。
2.2 标准溶液的配制 氧氟沙星溶液:精密称取氧氟沙星标准品50mg，以0.02%醋酸溶液定容至50ml得1.00mg/ml标准液。放入4℃冰箱保存。
临用时再用水稀释成工作液。 吡哌酸标准液:精密称取吡哌酸标准品50mg，以0.1mol/L KOH溶液定容至50ml得1.00mg/ml溶液。以水稀释成92μg/ml溶液，作为内标液使用。放入4℃冰箱保存。
2.3 兔眼房水样品处理方法 取100μl兔眼房水，加入20μl内标液，混匀。再加入100μl甲醇，旋涡振荡，14000r/min离心15min，取上清液20μl进样。兔眼房水色谱图见图1。
3 结果
3.1 标准曲线的制备 取空白房水100μl，加20μl内标液，再分别加入不同浓度氧氟沙星工作液配制成0.02、0.05、0.08、0.1、0.5、1、2、4μg/ml的系列溶液。按房水样品处理方法处理后测定。以氧氟沙星的浓度C（μg/ml）对氧氟沙星与吡哌酸的峰面积比Y作回归曲线，回归方程为:Y=-1.051+25.202C，r=0.9990。最小检出浓度为10ng/ml。
3.2 回收率的测定 在相同体积的空白房水和水中均加入一定量的氧氟沙星工作液与20μl内标液，配制成氧氟沙星的浓度为:0.01、0.1、1.0、4.0μg/ml，测得回收率分别为:（85.53±6.50）%，RSD7.60%;（95.31±5.44）%，RSD5.71%;（100.47±2.11）%，RSD2.10%;（99.32±2.74）%，RSD2.76%（n=3）。
3.3 日间及日内精密度的测定 在空白房水加入一定量氧氟沙星工作液使浓度分别为:0.01、0.1、1.0、4.0μg/ml。当日测定3次，隔日测定3次。日间RSD分别为:4.38%、5.43%、4.63%、4.39%。日内RSD为:2.74%、4.01%、 2.16%、4.24%（n=3）。
3.4 应用 取6只大白兔用泰利比妥滴眼液每15min点眼1次，共点眼6次，抽取房水，其余按2.3项处理，测定其氧氟沙星浓度如表1。图1 兔眼房水色谱图（a.空白样品，b.房水样品，in-内标，oflo-氧氟沙星） 表1 兔眼房水样品测定结果 （略）
4 讨论
由于喹诺酮类药物在RP-HPLC色谱分离方法或多或少地存在拖尾现象。使用乙腈-水溶液峰拖尾现象有所改善，乙腈浓度增大时可缩短保留时间。随着流动相中醋酸的浓度增大时，内标物与样品峰分离度逐渐缩小;而醋酸浓度减小时，分离比较完全，但保留时间延长。随着流动相中三乙胺的浓度增加，保留时间可缩短并减小样品峰的拖尾现象，但色谱柱和检测器平衡时间增加。经过筛选本实验采用的乙腈:1.6%醋酸（内含0.07mol/l三乙胺）=38∶62，对内标物与样品的分离以及保留时间都可得到满意的结果。本方法样品处理简便，灵敏度高，重现性好，分离度好，分析时间短。对氧氟沙星的药动力学和药效学的研究，具有一定的实用价值。
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（编辑秋 实）
作者单位:1110001辽宁沈阳中国医科大学实验技术中心
2110001中国医科大学附属第一医院眼科