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【摘要】 目的 探讨Gel Works1D软件应用于PCR扩增产物的定性与定量分析。方法 提取孕妇全血mRNA，经体外逆转录后，应用ε/γ引物引导扩增胎儿特异血红蛋白基因片段，同时用不同剂量标准mRNA经逆转录及PCR扩增后，经琼脂糖凝胶电泳，以凝胶成像系统扫描成像，用Gel Works1D软件分析凝胶图像，绘制标准曲线，对样品进行定性与定量分析。结果 在7例妊娠妇女中，6例扩增出ε/γ基因片段（274bp），1例为阴性。定量标准曲线公式:Y=-2.83×10 -5 X 2 +0.06045X-2.265，R 2 =0.9401，6份样品中，胎儿mRNA在孕妇外周血中的浓度平均25.72ng/ml，最大值33.66ng/ml，最小值20.84ng/ml。结论 Gel Works1D分析软件，可以对样品mRNA或DNA进行定性与定量分析，由于影响PCR扩增的因素较多，标准曲线的线性关系受到一定程度的限制，适当增加或减少逆转录时的模板量可克服上述缺陷。
关键词 RT-PCR ε/γ血红蛋白基因 Gel Works软件 定量分析
Using Gel Works software to quantity the products of PCR
Wang Binyou，Xu Tan，Chen Fei，et al.
Public Health College，Harbin Medical University，Harbin150001
【Abstract】 Objective Traditional prenatal diagnosis for congenital diseases were villus sampling and amnioˉcentesis.These invasive diagnosis methods are not only technical complicated，but also harmful to mother or fetus.Fetus in its different gestational age has its different type of hemoglobin or different amount of hemoglobin，especiallyεhemoglobin exiting in the body of10weeks gestation fetal，howeverγhemoglobin has its high amount before baby to be born.Butεandγhemoglobin did not exit in adults bodies.It is possible to use advanced molecularbiological technique to extract the fetal hemoglobin gene from maternal peripheral blood.We used non-invasive method to detect fetal hemoglobinε/γgene from maternal peripheral blood by molecular biological technique.The purpose is to useGel Works1D software to quality and to quantity the fetal mRNA in maternal peripheral blood.Methods Blood samples were collected and the fetal mRNA extracted from the pregnant women with the use of random primer.We also use standard mRNA to do experiment as the same as samples.Reverse transcription of mRNA into cDNA was carried out and cDNA was amplified by PCR with the specialε/γprimer used.Via1.2%EB in agarose gel electrophoresis，we used”Gel Works System”to scan the electrophoresis image.Gel Works1D can depict the qualitative and quantitative curves to detectε/γgene band and fetal mRNA.Results Using RT-PCR and agarose gel electrophoresis method，we detectε/γgene successfully in7samples（274bp），6positive and1negative.The standard quantitative curve is:Y=-2.83×10 -5 X 2 +0.06045X-2.265，R 2 =0.9401.Mean of concentration of fetal mRNA in maternal peripherˉal blood is25.72ng/ml，maximum33.66ng/ml，and minimum20.84ng/ml.Conclusion Gel Works1D is a set of software to us to quality and quantity the products of PCR and mRNA or DNA in samples.Because PCR was affected by a lot of factors，the good standard curve was restricted.Increasing or reducing sample template can avoid the deˉfect.
Key words RT-PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction） εandγgene of hemoglobin Gel works1D software quantitative analysis
胎儿红细胞与成人红细胞中γ和β球蛋白表达程度不同，这一原理可用来鉴别胎儿有核红细胞。Cheung等 ［1］ 利用抗γ球蛋白抗体，应用免疫组化的方法鉴别出胎儿有核红细。Bishchoff等 ［2］ 则设计了针对γ球蛋白cDNA的引 物，用PCR技术制备针对γ球蛋白的探针，利用FISH技术鉴别出了胎儿有核红细胞。我们用RT-PCR技术对孕妇外周血中的胎儿特异ε/γ血红蛋白基因进行体外逆转录及扩增，成功从孕妇外周血中扩增出胎儿特异性ε/γ基因 ［3］ 。本实验用Gel Works1D软件对孕妇全血中的胎儿mRNA进行定量分析，为探索正常与异常妊娠时孕妇外周血中胎儿mRNA浓度的变化奠定基础。
1 材料与方法
1.1 样本来源 采集妊娠8～32周孕妇静脉血5ml，用枸橼酸-枸橼酸盐-葡萄糖作抗凝剂，均为首次妊娠孕妇。样本由哈尔滨市第一医院妇产科提供。
1.2 方法
1.2.1 孕妇血中RNA的分离 常规提取孕妇全血RNA，终产物溶于50μl0.01%的焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonˉate，DEPC）中，存于-70℃备用。
1.2.2 mRNA的逆转录 试剂盒购于PROMEGA公司，按试剂盒说明操作。产物于-70℃冷冻保存备用。
1.2.3 PCR扩增胎儿特异血红蛋白基因ε/γ序列 寡核苷酸引物序列参照Furukawa ［4］，由上海生工生物工程公司合成。序列为:5′-GCAAGATGAATGTGGAAGA-3′（近端）;5′-CCCAGGAGCTTGAAGTTC-3′（远端）。常规PCR方法（PTC-100，MJ Research Inc.），热循环周期条件:变性94℃60s，退火57℃120s，延伸72℃120s，共35个循环，然后72℃延伸8min，于4℃条件下终止反应。
1.2.4 琼脂糖凝胶电泳 取扩增产物于1.2%的琼脂糖凝胶上电泳，以100个碱基对Marker为分子标尺（Pharmacia Biotech），ε/γ基因片段大小预计为274bp。每次扩增以标准阳性mRNA为对照（Amersham公司），标准mRNA来源于兔球蛋白mRNA，预计产生383bp的β球蛋白基因片段。设立空白对照。详细方法见文献 ［3］ 。
1.2.5 图像摄取与分析 凝胶成像系统（Pharmacia VDS USA）包含2个软件，Grat-It和Gel Works1D。光圈、焦距、速度调试至最佳状态时固定不变，Grat-It可摄取琼脂糖凝胶上的图像。（1）定性分析标准曲线的绘制:Gel Works1D软件依据Marker的不同分子量条带的位置，拟合出像素位置与片段大小关系的标准曲线，用于对片断大小的定性分析。（2）定量分析标准曲线的绘制:标准mRNA来源于免疫球蛋白mRNA，剂量由小到大依次是:4ng，8ng，12ng，16ng，20ng，24ng，28ng和32ng。经逆转录后取2.5μl进行PCR扩增，取5μl扩增产物上样电泳，预计产生383bp的β球蛋白基因片段。Gel Works1D软件对产生的图片进行分析，拟合出两条曲线，一条是用于校正不同图片的像素与光密度关系的标准曲线，另一条是用于定量分析样品中胎儿mRNA含量的像素总量与样品量关系的标准曲线。
2 结果
2.1 胎儿ε/γ的体外扩增 7例样品中，6例阳性，1例阴性。胎儿ε/γ基因片断大小为274bp（见图1）。
图1略
2.2 Gel Works1D对PCR扩增产物的定性分析 Gel Works1D软件依据Marker的不同分子量条带的位置，对图1拟合出的曲线方程式为:Y=0.03592X 2 -11.94X+1092，R 2 = 0.9978。此公式用于计算样品条带的片段大小。X是像素位置（Pixel position），Y是凝胶条带片段的大小（Base pair，bp）。由于电泳时受缓冲液、电流、上样液及EB等影响，条带的实际大小与程序计算的不能完全吻合，在本实验中6份样品的片断大小的均值为270.17bp，实际值为274bp，精确度为98.6%。
2.3 Gel Works1D对PCR扩增产物的定量分析
2.3.1 标准曲线的绘制 不同剂量的mRNA经逆转录及扩增后的电泳图像见图2。Gel Works1D软件对图2的像素值与光密度关系进行拟合后绘出曲线，以用于一个工作区的所有图像，保证这些图像的光密度值具有相同的基线，便于相互比较。拟合的像素值与光密度关系的曲线公式:Y=-1.36×10 -5 X 2 +0.01097X-0.4078，R 2 =0.9048。X代表原始像素值（Raw pixel value），Y代表光密度值（Optical density）。
图2 略
由Gel Works1D软件依据原始像素总量（Raw volume）和样品量（Volume.）的关系拟合出标准曲线，曲线公式:Y=-2.83×10 -5 X 2 +0.06045X-2.265，R 2 =0.9401（见图3）。横坐标是原始像素总量，纵坐标是参加反应的胎儿mRNA的量。这个标准曲线可用来对样品中胎儿mRNA进行定量分析。
图3 略
2.3.2 对样品中胎儿mRNA的定量分析 表1是Gel Works1D根据定量曲线对图1的分析结果。Volume是参与反应的mRNA的量，Base Pair是条带片段的大小，CON（concentraˉtion）是折算后胎儿mRNA在孕妇外周血中的浓度。本例中的6份样品中，胎儿mRNA在孕妇外周血中的浓度平均25.72ng/ml，最大值33.66ng/ml，最小值20.84ng/ml，Volum