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关键词 脱蛋白型松质骨 脱钙型松质骨 细胞内游离钙 碱性磷酸酶
In vitro studies on the effects of implanted materials on
introcelluar calcium and alkaline phosphatase of rat osteoblasts
Wang Lei，Lin He，Zhang Qingguo
Department of Plastic Surgery，Zhong Da Hospital，Southeast University，Nanjing210009.
【Abstract】 Objective To evaluate the effects of two implant materials:decalcified bone（DB）and deproˉteinized bone（DPB）on the concentration of intracellular free calcium and alkaline phosphatase activity of rat osˉteoblasts cultured in vitro，and expose the biological compatibility of the implant materialsas well as the index to estiˉmate cytocompatibility.Methods Osteoblast was derived from calvaria of newborn SD rats，transplanted onto decalciˉfied bone and deproteinized bone after the cells were purified，After7days of co-incubation，the cells were taken out to measure alkaline phospatase activity and the intracellular calcium concentration.Results Activity of ALP and conˉcentration of intracellular free calcium of the osteoblasts co-incubated with deproteinized bone were as normal as the control，but cells cultured with decalcified bone has higher activity of ALP and concentration of intracellular free calˉcium than those of them.Conclusion Both materials have no negative effects on osteoblasts.Decalcified bone can promote the abilities of the osteoblast.Activity of ALP and concentration of intracellular free calcium can be used as indices to evaluate biologicalcompatibility condition of implant materials.
Key words deproteinized bone decalcified bone introcellular free calcium alkaline phosphatase
成骨细胞是组织工程的效应细胞，在它生长分化和基因表达过程中，细胞内游离钙（Ca 2+ ）浓度和碱性磷酸酶（alkaline phospatase，ALP）活性可作为细胞分化的标志 ［1］ 。组织工程支架材料的细胞相容性可通过这两种物质的变化间接反映出来。本实验采用脱蛋白型松质骨（deproteinized bone，DPB）、脱钙型松质骨（decalcified bone，DB）与成骨细胞体外复合，研究不同支架材料对成骨细胞游离钙浓度和碱性磷酸酶活性的影响，来揭示两种材料的细胞相容性。
1 材料与方法
1.1 大鼠原代成骨细胞培养 采用酶消化法分离提纯成骨细胞。新生24h的乳大鼠10只（SD大鼠由东南大学医学院动物中心提供），取颅骨洗净后剪碎成1mm 3 大小。0.1%Ⅰ型胶原酶37℃消化15min，弃消化液，再次加入消化液，30min后弃去。PBS漂洗两次后加入消化液，37℃消化90min后收集上清液，1000rpm离心10min收集细胞，PBS漂洗并离心两次。加入10%小牛血清以1×10 6 /ml接种于50ml培养瓶中，于37℃、5%CO 2 培养箱中培养。传至第三代时用于实验。
1.2 单纯材料制备 猪DB、DPB均切割成10mm×10mm×3mm长方体，灭菌备用。
1.3 复合材料制备 将第三代成骨细胞制成1×10 6 /ml的细胞悬液，取1ml涂布于预湿的DB、DPB上，4h后，置于6孔培养板内采用气液箱悬浮培养，每种材料复合体设置12孔，另设12孔仅注入同量的细胞，为空白对照组。4天后更换培养液，继续培养3天后，作细胞内游离钙、碱性磷酸酶活性测定。
1.4 细胞内游离钙测定
1.4.1 主要仪器及试剂 Triton X-100（Amresco公司），EGTA（B.M公司），Fura-2/AM（Sigma公司）。650-60型荧光分光光度计（日本日立电气株式会社）。
1.4.2 标本处理 每组随机抽取6孔，用0.25%胰酶消化，1000rpm离心10min，弃上清，加入PBS漂洗，再次离心，弃上清，加入1ml PBS制成细胞悬液，细胞密度为1×10 6 /ml。
1.4.3 实验步骤 实验分三组，每组6支测试管。将细胞悬液于37℃预温5min，加入Fura-2/AM（终浓度5μmol/l）37℃恒温振荡45min，负载后的细胞以含0.2%牛血清蛋白的Hank’s漂洗两次，最后调整细胞终浓度为1×10 6 /ml，测定前细胞预先于37℃复温2～3min，于分光光度计内测定其发射光强度（F）和加入Triton X-100的最大荧光强度（Fmax）及加入EGTA的最小荧光强度（Fmin），用公式［Ca 2+ ］（nmol/L）=F-Fmin/Fmax-F计算［Ca 2+ ］。
1.5碱性磷酸酶测定
1.5.1 主要仪器及试剂 Triton X-100（Amresco公司），磷酸对硝基苯酯二钠（p-NPP），721分光光度计（上海）。
1.5.2 标本处理 每组随机抽取6孔，用0.25%胰酶消化，1000rpm离心10min，弃上清，加入PBS漂洗，再次离心，弃上清，加入1ml PBS制成细胞悬液，细胞密度为1×10 6 /ml。
1.5.3 实验步骤 实验分3组，每组6支测试管。每支试管加入等量的1%Triton X-100孵育5min，制成细胞裂解液。取1ml细胞裂解液加入Na 2 CO 3 -NaHCO 3 （0.1mol/L）和p-NPP（9mol/L）各1ml，37℃水浴15min，立即加入2ml NaOH（0.5mol/L）终止反应，测定吸光度OD 405 ，用公式ALP含量（μ·ml -1 ·min -1 ）=（OD 405 ×1000）/18.8×1/15×5测定ALP含量。
2 结果
2.1 细胞内游离钙浓度 各组中成骨细胞内游离钙浓度见表1。DPB组与空白对照组细胞内游离钙浓度差异无显著性（P>0.05），DB组与空白对照组及DPB组差异有显著性（P<0.05）。
表1 各组中成骨细胞内游离钙浓度测定结果
注:P 0 为各组与对照组比较，P 1 为各组与DB组比较
2.2 碱性磷酸酶活性 各组中成骨细胞碱性磷酸酶活性见表2。由表2可知，DPB组与空白对照组碱性磷酸酶活性差异无显著性（P>0.05），DB组与空白对照组及DPB组差异有显著性（P<0.05）。
表2 各组中成骨细胞碱性磷酸酶活性测定结果
注:P 0 为各组与对照组比较，P 1 为各组与DB组比较
3 讨论
成骨细胞的生长分化和基因表达经历3个阶段:（1）生长增殖期，以DNA复制、组蛋白合成为特征;（2）基质形成、成熟期，以碱性磷酸酶活性增高、I型胶原分泌为特征;（3）基质钙化期，以骨钙蛋白分泌、钙离子沉积为特征，并伴有 碱性磷酸酶活性持续升高。碱性磷酸酶能够反映成骨细胞合成I型胶原，形成骨基质的能力，是成熟成骨细胞的标志［2］ 。而钙离子是细胞功能调节中的第二信使，细胞内游离钙升高激活各种钙结合蛋白，将刺激信息传递给细胞内多种酶反应系统或功能蛋白。脱钙型松质骨是一种自体降解的抗原灭活骨质，不引起免疫反应。它除了主要成分胶原外，还含有诱导新骨形成的骨形成蛋白（BMP） ［3］ 。实验中DB组细胞内游离钙及ALP活性升高，其机理可能如下:（1）BMP通过细胞膜上的第一信使通道系统，将DNA合成的启动信号传递给相应的靶位，进而激活包括钙调素（CaM）在内的钙结合蛋白（第二信使），启动信号再由第二信使传递给位于细胞核内的相应转录因子，上调I型胶原基因家族转录和翻译的水平。（2）DNA拷贝数的大幅增加，导致目的基因的蛋白表达水平同步升高，I型胶原蛋白合成、分泌增多，相应在组织学中表现为基质成熟、钙化过程加快。与此同时，反映成骨细胞合成I型胶原，形成骨基质能力的ALP活性升高，可能也跟BMP上调其相应基因表达蛋白的能