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【摘要】 目的 研究检测卵巢上皮性浆液性肿瘤中KDR mRNA的表达及其临床意义。方法 采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）扩增KDR基因，以β-actin基因作为内对照，结合凝胶图像扫描，以KDR/β-actin作为KDR相对表达量分析卵巢上皮性浆液性肿瘤70例。结果 卵巢浆液性癌及卵巢交界性浆液性瘤中KDR mRNA的表达高于卵巢良性浆液性瘤及正常卵巢。在卵巢上皮性浆液性癌中，KDR mRNA的表达与FIGO分期、腹腔细胞学检查结果、有无淋巴结转移、有无盆腔粘连有关。结论 KDR在卵巢癌的发生、发展及转移中起重要的作用。
关键词 卵巢肿瘤 KDR 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）
Expression and role of KDR mRNA in patients
with epithelia ser-tumor of ovary
Zhou Ye，Wang Min
Department of Obstetrics and Gynecology，Affiliated Hospital of Shenyang Medical University，Shenyang110024.
【Abstract】 Objective To explore the expression and clinical significance of kinase insert domain-containˉing receptor（KDR）mRNA in epithelia ser-tumor of ovary.Methods Revert polymerase chain reaction（RT-PCR）and gel-image analysis system were used to analyse the expression of KDR mRNA in70cases with ovarian tumor.Results KDR mRNA in cases with ovarian serous carcinoma and borderline ovarian serous tumor expresses more than that in cases with ovarian serous tumor and normal ovarian tissue.In cases with ovarian serous carcinoma，KDR mRNA expresses differently in FIGOⅢ，ⅣandⅠ，Ⅱ，in two groups with different result of adbominal cavity cells examinaˉtion in two teams that with or without lymph node metastasis and in two teams with or without the pelviccavity adheˉsion.Conclusion KDR mRNA maybe play an important role in the express carcinogensis，development and metastasis in ovarian serous carcinoma.
Key words ovarian tumor kinase insert domain-containing receptor（KDR） reve rsetranscription-polyˉmerase chain reaction（RT-PCR）
实体肿瘤的生长、代谢及转移需要持续的肿瘤血管生成。在众多新生血管诱生剂中，血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是促进肿瘤血管生成的最重要的因子之一。近年来的研究资料证明VEGF是通过与其特异的受体-KDR（Kinase insert domain-containing receptor）相结合发挥作用的。KDR属于细胞表面的酪氨酸激酶受体，主要在血管内皮细胞表达，但在其他组织细胞也检测到KDR的表达，如巨噬细胞和某些血液细胞、肿瘤组织。本研究用RT-PCR结合计算机条带密度半定量方法检测各种卵巢肿瘤组织VEGF受体KDR mRNA的表达水平并进行统计学分析。为在分子水平干预肿瘤血管增生及预防卵巢癌转移、复发提供依据。
1 材料与方法
1.1 研究对象 选取2000年3月～2002年3月在中国医科大学第二临床学院妇产科行手术切除的卵巢上皮性浆液性肿瘤组织的患者，年龄20～70岁，平均43.1岁。包括卵巢浆液性癌30例，卵巢交界性浆液性瘤10例，卵巢良性浆液性瘤30例。卵巢浆液性癌FIGO分期（1986年）:Ⅰ、Ⅱ期8例，Ⅲ、Ⅳ期22例;组织学分级高分化8例，中、低分化22例;腹腔细胞学检查阳性24例;淋巴结转移14例;伴盆腔粘连20例。标本均经病理检查证实。选用来自全子宫切除同时行卵巢切除的10例正常的卵巢组织作为对照。
切下的组织标本用生理盐水冲洗3次后，装于0.1%DEPC水处理过的干燥试管中，30min内置于液氮中，然后置于-70℃的冰箱中保存待检。
1.2 方法
1.2.1 主要试剂 提取总RNA的TriZol试剂为美国Promega公司产品。RT-PCR试剂盒由大连宝生生物工程有限公司提供。引物由北京奥科生物有限责任公司合成。电泳用琼脂糖由沈阳联星生物公司提供。
1.2.2 引物合成 KDR引物序列为:P 1 :5′-TAT ATA TGG TGT AAC CCG GA-3′（1182-1201）;P 2 :5′-TTT GTC ACTˉGAGACAGCTTGG-3′（1176-1736）。内参照β-actin引物序列为:P 1 :5′-TGTATGCCTCTGGTCGTACCAC-3′;P 2 :5′-ACAGAGTACTTGCGCTCAGGAG-3′;KDR扩增片段长度为555bp，β-actin扩增片段长度为690bp。
1.2.3 RNA提取及cDNA合成 提取后1μl RNA加入cDˉNA合成反应体系，以90℃孵育3min，42℃30min合成cDˉNA。
1.2.4 PCR扩增 取已合成cDNA1.5μl加入PCR反应体系，94℃1min，55℃2min，72℃1min，在扩增仪上进行如此35个循环。
1.3 电泳和图像分析 取PCR产物7μl加在含0.5μg/ml EB的琼脂糖胶电泳中，紫外光检测仪上出现555bp的分子条带为阳性结果。以结肠癌KDR mRNA提取物作为阳性对照，以蒸馏水代替mRNA提取物作为空白对照，以β-actin作为内对照。各种卵巢肿瘤组织标本的KDR PCR产物水平，通过电泳后条带密度与内对照密度的比值进行定量评估，计算公式为D′KDR=DKDR/Dβ-actin 。
1.4 统计学方法 用SPSS软件对实验结果进行统计学分析。KDR mRNA表达水平采用χ 2 检验。相对含量采用方差分析和t检验。
2 结果
2.1 KDR在各种卵巢肿瘤组织中的表达及含量 各种卵巢肿瘤组织中KDR mRNA经RT-PCR扩增产物表达率及相对含量结果见表1。
由表1可以看出，KDR mRNA在四种组织中均可表达。KDR mRNA在卵巢浆液性癌及卵巢交界性浆液性瘤组织中的表达与在卵巢良性浆液性瘤组织中结果比较差异有非常显著性（P<0.01）;与正常卵巢组织中结果比较，差异亦有显著性（P<0.05）。KDR mRNA在卵巢良性浆液性瘤组织与正常卵巢组织中结果比较差异无显著性（P>0.05）。但在卵巢浆液性癌与卵巢交界性浆液性瘤组织中，KDR mRNA的表达结果差异无显著性（P>0.05）。
表1 各种卵巢上皮性浆液性肿瘤与正常卵巢组织中KDR mRNA表达水平比较 略
但卵巢浆液性癌组织中KDR mRNA的相对含量明显高于其它三组，经统计学分析，其差异有非常显著性（P<0.01）。而其它三组之间，KDR mRNA的相对含量结果比较差异无显著性（P>0.05）。
2.2 KDR mRNA与卵巢浆液性癌临床病理特征的关系 见表2。
由表2可以看出，KDR mRNA的表达率及相对含量在卵巢浆液性癌临床分期Ⅲ、Ⅳ期组与Ⅰ、Ⅱ期组的结果比较差异有显著性（P<0.05）;在腹腔细胞学检查阳性及阴性的两组中KDRmRNA的表达率及相对含量结果比较差异有显著性（P<0.05）;在有无淋巴结转移的两组之间，KDR mRNA的表达率及相对含量结果比较差异有非常显著性（P<0.01）;而在有无盆腔粘连的两组中，KDRmRNA的表达率结果比较差异有显著性（P<0.05），相对含量的结果比 较差异有非常显著性（P<0.01）。但在不同的组织分级及腹腔积液量中，KDR mRNA的表达率及相对含量结果比较差异无显著性（P>0.05）。
表2 KDR的表达与临床病理特征的关系 略
3 讨论
血管生成为实体瘤生长和转移所必需。VEGF是新生血管形成中最重要而直接的血管内皮细胞刺激因子。近年来的研究表明，在缺失VEGF另一受体-Flt-1基因的细胞中，用VEGF激活KDR后可导致细胞有丝分裂;但在缺乏KDR基因的细胞中，用VEGF激活Flt-1后则不能诱导细胞增殖。因此，认为KDR可能是VEGF发挥主要功能的受体 ［1］ 。VEGF不仅通过激活血管内皮细胞的受体诱导血管形成，间接促进肿瘤细胞的生长，而且还可通过激活肿瘤细胞上的受体，直接促进肿瘤的生长 ［2］ 。VEGF与受体结合后，能特异性激活血管内皮细胞膜上的酪氨酸激酶而发生一系列生物效应，如促进血管内皮细胞的增殖，增加血管的通透性，改变细胞外基质等。VEGF也只有与受体结合后才能发挥其生物学作用 ［3］ 。在正常情况下，KDR仅存在于血管内皮细胞和一些肿瘤细胞中，表达水平很低，大多数组织中不能检出。但是，当条件发生改变时，情况也发生变化。本研究结果显示，KDR mRNA在卵巢浆液性癌及卵巢交界性浆液性瘤中的表达率、相对含量明显高于正常及卵巢良性浆液性瘤组织，而在卵巢良性浆液性瘤组织与正常卵巢组织之间以及卵巢浆液性癌与卵巢交界性浆液性瘤之间，KDR mRNA的表达率、相对含量则差异无显著性。Boocock等 ［2］ 报道的结果与我们的研究结果相一致。提示KDR与卵巢恶性肿瘤的发生、发展有关，可作为判断卵巢肿瘤良、恶性的指标之一。
卵巢癌是女性常见的恶性肿瘤，随着医学进步，临床诊治水平明显提高，但5年存活率仍很低，约为20%～30%。转移是卵巢癌临床治疗失败的主要原因，很多外观局限的肿瘤却早已发生了亚临床转移。血管生成是肿瘤生长和转移的基础，新生血管为肿瘤提供足够的营养物质和氧，运走代谢产物，因此，肿瘤细胞的浸润和转移依赖于新生血管的形成。本研究表明，KDR mRNA的表达与FIGO分期、腹腔液细胞学检查结果及有无淋巴结转移有关，这提示着KDR与肿瘤的生长和转移密切相关。另外，本研究中，KDR mRˉNA的表达与盆腔有无粘连密切相关。Wiczyk等 ［4］ 曾报道，盆腔粘连程度也是卵巢癌预后的一项指标。VEGF通过与KDR相结合，能促进盆腔内粘连形成，有利于肿瘤细胞扩散，加大肿瘤细胞减灭术难度及危险性，使患者预后更差。近年来，不少学者研究认为，KDR是卵巢癌患者独立的预后因素，若与VEGF同时表达，提示预后更差 ［5，6］ 。所以，KDR不仅与卵巢肿瘤的良、恶性有关，而且与肿瘤转移及其预后有关，它可能成为反映卵巢肿瘤生物学行为和指导临床治疗、判断预后的有价值的指标。
总之，KDR在卵巢癌的发生、发展及转移中发挥重要的作用。近年来，以新生血管为靶点对肿瘤进行生物治疗已成为研究热点。VEGF及其受体为肿瘤的药物治疗和基 因治疗提供了特异性较高的靶点，可与其它抗肿瘤药物