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关键词 大黄 小鼠腹腔巨噬细胞 吞噬功能 一氧化氮 白细胞介素-1
大黄性寒、味苦，具有泻热通便、凉血解毒、逐瘀通经之功效。过去大黄主用于实热便秘，积滞腹瘀，作为泻下药使用。近年来随着对大黄研究的不断深入，发现其对多种炎症性疾病有较好的疗效 ［1］ 。为探讨大黄抗炎作用的机理，本研究利用小鼠体外培养小鼠腹腔巨噬细胞系统，研究大黄对LPS活化的巨噬细胞的吞噬功能和产生NO、IL-1的调节作用。
1 材料与方法
1.1 药物和试剂 大黄煎剂（取生大黄20g加水煎10min，制成水煎剂100ml，含生药200mg/ml，经滤过除菌后放4℃保存），LPS（Sigma公司产品），RPMI-1640培养基（Gibco产品），无酚红RPMI-1640培养基（Sigma公司产品），胎牛血清（FBS，超级，杭州四季青生物工程材料研究所），ConA（Sigma公司产品），MTT（Fluka），NO检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，余为国产分析纯试剂。
1.2 动物和仪器 KM小鼠，6～8周龄，体重20～25g，由广东医学院实验动物中心提供。Σ960型全自动酶标仪（Metertech公司）。
1.3 小鼠腹腔巨噬细胞的制备 取5只小鼠，每只腹腔内注射无血清RPMI-1640培养液2ml，15min后颈椎脱臼处死小鼠，75%（体积分数）酒精浸泡15min，收集腹腔内液，1000r/min离心5min收集细胞，用含10%灭活胎牛血清的RPMI-1640培养液调整细胞浓度至10 6 /L。取24孔培养板每孔加细胞悬液1ml，置5%（体积分数）CO 2、37℃培养2h，倾去上清液，用无酚红RPMI-1640培养液洗去未贴壁细胞，培养孔内为巨噬细胞。实验分4组，分别加入1ml含10～1000mg/L大黄煎剂的无酚红RPMI-1640-10%FBS培养液，并加入LPS使终浓度为20μg/ml。置5%（体积分数）CO 2 、37℃培养。
1.4 巨噬细胞吞噬中性红试验 ［2］ 取上述培养24h的细胞，每组取6孔细胞，每孔中加入的中性红生理盐水液，使终浓度为1g/L，继续培养20min。PBS洗细胞3次，每孔加入细胞溶解液（乙酸:无水乙醇=50:50）1.0ml，室温放置2h，待细胞溶解后，吸取上清液0.2ml放入酶标板中，于酶标仪上测波长540nm处吸光度A值。以A值表示巨噬细胞吞噬功能的强弱。
1.5 巨噬细胞产生NO的测定 取上述培养12h的细胞培养上清液，每组取6孔，根据Griess反应检测上清液的O 2 ·- 量间接反映巨噬细胞NO的生成量 ［3］ 。
1.6 巨噬细胞产生IL-1的检测 取培养12h的细胞培养上清液，每组取6孔，采用胸腺细胞增殖法检测IL-1［4］ 。在96孔平底板中，每孔加入不同稀释度的细胞培养上清液0.1ml和ConA-胸腺细胞液0.1ml（细胞浓度107/ml，ConA终浓度为2mg/L），37℃，5%（体积分数）CO 2 培养箱培养，以MTT比色法测定胸腺细胞增殖。
1.7 统计学方法 采用SPSSV9.0统计软件进行F检验和q检验。
2 结果
2.1 大黄煎剂对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的影响 见表1。
表1显示，所选择的各浓度大黄煎剂均有较强的抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的作用。
表1 大黄对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的影响 （略）
注:与LPS组比较， ˇ P<0.01
2.2 大黄对小鼠腹腔巨噬细胞产生NO的影响 见表2。表2显示，加入大黄煎剂的各组小鼠腹腔巨噬细胞产生NO的量均明显低于LPS对照组，且与剂量呈反比。
表2 大黄对小鼠腹腔巨噬细胞产生O 2 ·- 的影响 （略）
注:与LPS组比较， ˇ P<0.01
2.3 大黄对小鼠腹腔巨噬细胞产生IL-1的影响 见表3。表3显示，除10mg/L组外，各大黄煎剂组均能显著降低LPS活化小鼠腹腔巨噬细胞产生IL-1的量，且与剂量呈反比。
表3 大黄对小鼠腹腔巨噬细胞产生IL-1的影响 （略）
注:与LPS组比较， ˇ P<0.01
3 讨论
大黄是我国传统中药，其性味苦寒，入脾胃、大肠、肝、 心包经。以泻下健胃而著称于世，随着对大黄药理作用、临床应用研究的深入，发现大黄还具有抗肿瘤、保肝利胆、改善肾功能，活血止血，降血脂和抗炎等方面作用。近年来发现大黄对多种炎症性疾病有较好的的治疗效果 ［1］ ，如急性肺损伤 ［5］ 、全身炎症反应综合征 ［6］ 等。为了探讨大黄抗炎作用的机理，本实验观察大黄煎剂对LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞功能的调节作用。结果发现大黄煎剂可明显抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的作用，并能抑制巨噬细胞产生NO和IL-1的能力，且呈现剂量依赖关系。巨噬细胞是机体免疫系统的一种重要的免疫细胞，在固有性免疫和获得性免疫中均起着至关重要的作用。但巨噬细胞也是一种重要的炎症细胞，巨噬细胞对炎症反应起双重调节作用，巨噬细胞能分泌多种生物活性物质，如NO、IL-1、TNF-α、活性氧等，促进炎症反应，加速对有害物质的清除;同时巨噬细胞也能吞噬处理过渡活化的中性粒细胞，控制炎症反应在适当的范围。但巨噬细胞释放的生物活性物质也是重要的炎症介质，产生过多会引起炎症性损伤 ［7］ 。因此，目前认为适度调控巨噬细胞的活化对某些炎症性疾病的治疗具有重要意义 ［8］ 。研究发现大黄能降低全身炎症反应综合征患儿血清中TNF-α、CRP、C 3 、C 4 量，对炎症因子有拮抗作用 ［6］ 。大黄煎剂能降低多发伤并严重感染患者血中内毒素、IL-6和NO的含量 ［9］ ，从而抑制炎症反应。有关大黄对巨噬细胞功能的调节作用的报道少见，但发现大黄素对大鼠腹腔巨噬细胞生物合成白三烯B 4［10］ 和产生TNF-α、IL-1、IL-6等均具有抑制作用 ［11］ 。大黄素是大黄的重要单体，目前发现其具有抑菌、抗炎及免疫调节作用 ［12］ 。本研究结果提示大黄煎剂不仅能下调LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞分泌炎性细胞因子，同时也能抑制LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能，防止巨噬细胞过渡活化，从而控制炎症反应。因此，下调巨噬细胞的免疫功能可能是大黄抗炎作用的机制之一。
参考文献
1 王晨，夏德超，尹雄章.大黄在治疗炎性疾病中的应用.中国药师，2003，6（6）:377-378.
2 王小京，丁桂凤，范少光.几种阿片肽及ACTH对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的作用.中国免疫学杂志，1987，3（3）:211.
3 Ding AH，Nathan CF，Stuehr DJ.Release of reactive nitrogen intermediˉates and oxgen intermediates from mouse peritoneal macrophages.J Imˉmunol，1988，141（11）:2407-2412.
4 徐军发，侯敢，黄迪南，等.酵母多糖对小鼠腹腔巨噬细胞产生一氧化氮和白细胞介素-1的影响.中国生化药物杂志，2002，23（2）:67-69.
5 李春盛，桂培春，何新华，等.大黄对内毒素诱导急性肺损伤大鼠的保护作用.基础医学与临床，2001，21（1）:65-68.
6 彭淑梅，王淑珍，赵建平.大黄对炎症反应综合征患儿炎性细胞因子和补体的影响及意义.中国中西医结合杂志，2002，22（4）:264-266.
7 Malyshev IY，Shnyra A.Controlled modulation of inflammatory，stress and apoptotic responses in macrophages.Curr Drug Targets Immune Enˉdocr Metabol Disord，2003，3（1）:1-22.
8 Grip O，Janciauskiene S，Lindgren S.Macrophages in inflammatory bowel disease.Curr Drug Targets Inflamm Allergy，2003，2（2）:155-60.
9 肖桂林，刘发益，金益强.大黄煎剂对多发伤并严重感染患者血中内毒素、白细胞介素-6和一氧化氮的影响.中华创伤杂志，2002，18（8）:482-484.
10 焦建杰，翁福海，胡萍.大黄素对大鼠腹腔巨噬细胞生物合成白三烯B4的影响.天津医科大学学报，1996，2（3）:11-13.
11 张骏，翁福海，李会强.大黄素对大鼠腹腔巨噬细胞产生TNF-α、IL-1、IL-6及细胞Ca 2+ 的影响.中草药，2001，32（8）:718- 720.
12 张喜平.大黄素的药理作用研究概况.中国药理学通报，2003，19（8）:851-854.
ˇ 基金项目:广东省湛江市科技攻关项目（编号:ZK0123）
作者单位:524023广东湛江广东医学院检验系