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1 细胞色素C的释放与细胞凋亡的关系
现已有很多的实验 ［1～4］ 表明:细胞色素C（Cytochrome C，Cyt C）的释放在内源性途径的细胞凋亡过程中占有核心地位。试验过程中，人们不仅发现细胞受到诱发凋亡的因素作用后，线粒体内的Cyt C重新分布于线粒体之外，而且这种重新分布于或者同步于Caspase9的活化和DNA片断的形成。应用Caspase抑制剂Z-VAD.fmk不能减少Cyt C的释放，这也证明了Cyt C的释放位于Caspase的激活之前。此外，Cyt C -/- 细胞可以抵御由于紫外线、叉胞素（stauˉrosprine）、鬼臼乙叉苷（etoposide）作用而导致的细胞凋亡 ［5］ 。正常情况下Cyt C是由核基因编码，与其他线粒体蛋白不同的是，Cyt C进入线粒体并不需要保守的N末端引导区域的参与。一旦Cyt C位于线粒体膜间区域，Cyt C亚铁血红素裂合酶（Cyt C heme lyase）便可以催化Cyt C和亚铁血红素基团（heme）的结合，从而改变Cyt C的结构，使得后者无法通过线粒体外膜 ［6，7］ 。实验 ［8］ 表明单纯Cyt C基因或者heme基团都没有诱发细胞凋亡的能力。由此看来，heme同Cyt C的结合对于诱发凋亡是必需的。而且由于成熟Cyt C加热之后就失去了诱导凋亡活性，证明了保持Cyt C的空间结构是使Cyt C保持诱导凋亡活性的必要条件 ［8］ 。尽管heme在Cyt C中是电子转移的载体，但是成熟Cyt C的氧化还原性质和它的诱导细胞凋亡的性质并没有关系。因为以其他基团取代heme基团后的Cyt C尽管失去了转移电子的能力，但仍然具有诱导凋亡的能力 ［8，9］ 。也同时证明了成熟Cyt C的空间结构是其导致细胞凋亡发生的关键。当然，除了参与形成凋亡复合物之外，Cyt C的释放也可以导致其他途径的细胞死亡，例如增加活性氧（ROS）的产生导致的细胞死亡，以及导致AIF的释放导致的非Caspase依赖型细胞凋亡。
2 细胞色素C的释放机制
正常时，Cyt C存在于线粒体的膜间区域，它的释放机制如今有两种模式可供参考，体积依赖性模式。即线粒体的基质体积的增加导致线粒体的肿胀从而导致接下来的线粒体外膜的破裂以及线粒体膜间区域内容物的释放，包括Cyt C和其他的一些正常时存在于线粒体膜间区域的蛋白，如Smac/Dlablo，EndoG。第二种机制为体积非依赖性模式。该模式中线粒体外膜通透性选择性的改变，允许Cyt C漏出，而不伴有线粒体肿胀。而线粒体外膜通透性改变的方式亦可分为两种:线粒体膜PT孔道的开放和其他的线粒体外膜通道开放。PT孔道开放之后，可以导致线粒体去极化，正常时存在的线粒体内膜跨膜H + 梯度的消散和无通透选择性的离子和水的内流，导致线粒体基质体积的增加。
尽管一些公认的诱导细胞凋亡的因素如:Ca 2+ 内流增加、氧化应激等因素可以直接导致PT孔道的开放和线粒体膜间内容物的释放，但是也有实验表明PT孔道的开放位于Cyt C释放和Caspase激活之后 ［10］ 。其他的一些线粒体外膜通道的开放却可以导致线粒体内膜电位的超极化，继之发生Cyt C的释放 ［11～13］ 。
首先，我们先就没有线粒体PT孔道参与的Cyt C的释放机制作一探讨:实验 ［11］ 表明staurosprine（STS:作为一种凋亡诱导剂可以在多种细胞中诱导细胞凋亡的发生）或者Bax诱导的Cyt C的释放过程同Fas，Ca2+ 、ROS诱导的Cyt C的释放过程并不一致。不仅STS诱导的Cyt C的释放时间早于后者，且STS诱导的Cyt C的释放过程中，线粒体基质内先出现基质的pH值的升高和细胞内pH值降低，同时伴有线粒体内超极化（△Ψm的升高），随后出现Cyt C的释放、Caspase激活、线粒体基质pH值下降、线粒体去极化（△Ψm的降低）和PT孔道的开放，最终导致细胞凋亡的发生。而对于Fas来说，线粒体基质以内pH值和△Ψm开始时并无明显变化，随后出现Cyt C的释放，线粒体基质pH值的下降和PT孔道的开放。进一步的研究表明，STS诱导的Cyt C的释放与H +泵F 0 F 1 -ATPase的参与有关，而后者与细胞凋亡之间的关系也已经被证实 ［14］ 。因为以特异的泵抑制剂oligomycin可以抑制细胞经STS刺激后发生的线粒体基质pH升高，超极化和Cyt C的释放，并最终减少了凋亡的发生。而广义的Caspase抑制剂Z-VAD-FMK不能改变以上过程。当Oligomycin作用于经Fas作用的细胞后，并不能减少最终的细胞凋亡的发生。但是Z-VAD-FMK可以减少Fas诱导的线粒体pH值的降低，去极化和PT孔道的开放。Bax可以与F 0 F 1 -ATPase结构中的ATP4部分相结合，参与了Cyt C的释放过程，但是也有实验表明Bax诱导Cyt C释放的机制是Bax介导了线粒体PT孔道的开放引发线粒体膜间物质的释放，包括Cyt C。因此Bax的作用机制有待进一步明确。除了有F 0 F 1 -ATPase参与Cyt C的释放以外，另外线粒体内膜表面的K + 通道也有可能参与了Cyt C的释放。实验 ［30］ 表明，当增加细胞内的K + 含量或者使用K + 载体valinomycin可以减少Cyt C的释放，同时这些物质也可以消除由于STS的作用导致的早期线粒体内超极化现象。由于valinomycin可以引发线粒体内的去极化，可以推断正是由于valinomycin引发了线粒体K + 通道的开放导致了K + 的内流（去极化）抑制了STS诱发的线粒体超极化从而抑制了Cyt C的释放。同样的现象也可以发生于当KCOs（potassium channel openers，钾通道开放剂）作用于线粒体时，例如二氮嗪，可以导致线粒体内膜去极化，减少了细胞凋亡的产生，从而发挥心肌细胞或脑细胞的保护作用 ［15～17］ 。以上的实验虽然表明F 0 F 1 -ATPase、Bax、K + 通道都参与了Cyt C的最初释放过程，但是它们是构成了某一通道的一部分还是这些因素诱导了一个尚未知晓的Cyt C释放通道的开放尚不得而知。此外，也有实验 ［18］ 表明，线粒体PT孔道的开放可以先于Cyt C的释放或者阻滞线粒体PT孔道可以减少或抑制Cyt C的释放，表明PT孔道参与了Cyt C的释放。一般认为，PT孔道是由ANT（腺嘌呤核苷酸转移酶），环孢菌素A受体D（cyclophilin D），VDAC（电压依赖性通道）组成的复合体。该复合体位于线粒体内膜和外膜相结合的部位，这就使得位于线粒体内膜上的ANT可以较为接近线粒体外膜上的VDAC。正常情况下，ANT是ADP/ATP的交换部位，且受到Bcl-xl的调节。当受某种因素的刺激（Ca 2+ 内流，氧化应激，BID或BAX的激活）而导致PT孔道开放的时候，便可以形成非选择性的通道，可以允许至少1.5kD的物质通过，继而引发线粒体内膜去极化，线粒体基质内容物增加，进而导致线粒体外膜破裂，膜间蛋白质的释放。这一过程可以被Bcl-XL和Bcl-2的高表达或是应用环孢素A（CsA）所抑制。其中CsA的作用是由于它可以和cyclophilin D相互作用，关闭了PT孔道 ［19，20］ 。VDAC正常时可能行使调节ADP进入线粒体膜间区域的作用，因为如果△Ψm的变动范围超过±20mV，VDAC就处于关闭状态，降低对ADP的通透性。由于VDAC正常时孔径只有约2.6nm，不足以使Cyt C通过。但当Bcl-2家族中的促凋亡蛋白作用与线粒体膜的脂质双分子层后，VDAC中的脂质部分就会发生相应变化，从而可以产生对Cyt C的通透性 ［21］ 。由此表明，当线粒体PT孔道（尤其是ANT）激活后，也可以参与Cyt C的释放过程。但是，PT孔道开放并不仅针对Cyt C，还包括其他线粒体膜间蛋白的释放，如AIF，SMAC，Endo G等。后者的释放也有它们本身的重要生物学效应。
3 活性氧同细胞色素C释放的关系
活性氧（ROS）的生成增加导致细胞损伤已经是一个共识。研究表明，ROS也可以促进Cyt C的释放 ［22］，以STS或FAS，TNF-α等因素处理的细胞在凋亡发生之前有明显的细胞内ROS生成，Bcl-2的过表达可以明显减少其生成。最初据此曾认为Bcl-2具有抗氧化性质，但是后来的研究表明:在以上因素的作用下，先有Cyt C的释放增加，后有ROS的增加，Bcl-2由于减少了Cyt C的释放而减少了ROS的生成 ［23］ 。Ca 2+ 在线粒体内的聚集不仅可以由于导致线粒体PT孔道形成直接使ROS的产生增加 ［24］ 。还可以通过降低Cyt C氧化酶的活性干扰电子传递链，导致ATP的合成下降和ROS的增加 ［25］ 。ROS的生成增加可以对细胞生长有明显的损伤作用。针对线粒体而言，它可以导致线粒体PT孔道的开放 ［26］ ，进一步引发线粒体内容物的释放，从而形成一个放大效应的恶性循环。此外，ROS还可以导致PARP的激活，引发AIF的释放 ［18］ 。
4 Bcl-2家族成员对于细胞色素C释放的调节
众多实验表明，Bcl-2家族蛋白是最重要的线粒体通透性调节剂 ［27～29］ 。Bcl-2家族可以按在凋亡中的作用分为抗凋亡家族，如Bcl-2，Bcl-xl等和凋亡前家族如Bid，Bax，Bak等。而按照含有Bcl同族区域（BH）的数目又可以分为Bcl-2，Bcl-xl，Bcl-xs包含BH1，BH2，BH3和BH4;Bak，Bax包含有BH1，BH2和BH3区域，而Bid，Bim，Bad，Bik，Nix，Noxa只含有BH3区域，称为BH3-only亚家族。其中，由于BH4区域只包含在抗凋亡蛋白中，因此人们认为它是Bcl-2蛋白等行使抗凋亡功能的必要因素。去除了BH4区域的重组Bcl-2或者由于病毒作用导致的BH4区域的分离的Bcl-2失 去了抗凋亡的作用转而发挥凋亡前体的作用。BH4可以和VDAC中的脂质相结合，从而发挥抑制VDAC的开放和Cyt C释放的功能。失去了BH4区域的重组Bcl-xl和Bcl-2也失去了抑制Cyt C释放和细胞凋亡的功能 ［30］ 。而BH3-only亚家族的成员大多数发挥凋亡前蛋白的作用，这是该家族成员通过和抗凋亡蛋白或是促凋亡蛋白的异源性结合从而使得后者失去抗凋亡活性或者促进凋促亡活性 ［31］ ，从而实现对Bcl-2家族成员的调节。
Bcl-2家族成员的C末端都有一跨膜区域，这便可以使其铆钉于线粒体膜上。正常情况下，抗凋亡分子可以稳定的结合于线粒体膜的表面，而凋亡前分子与线粒体膜的结合却是一动态过程。即在正常情况下，与线粒体膜结合的Bcl-2，Bcl-xl，其可能的作用是可以和线粒体PT孔道相结合参与ADP/ATP的交换 ［32］ 。而当细胞受到诸如缺血，STS，P53，生长因子撤退，秋水仙碱等因素的刺激后，便可以引发原存在于细胞质中的凋亡前因子如:Bax，Bim，Bid等的重新分布，与线粒体相结合，诱导Cyt C的释放。同时，Bax，Bak不仅可以诱导Cyt C的释放，还可以诱导AIF的释放和线粒体内膜电位的消散 ［33］ 。而BH3-only亚家族成员Bid，Bim只可以引发Cyt C的释放并不伴有线粒体内膜电位的消散且CsA可以抑制Bax诱发的凋亡但是却对于Bid，Bik诱导的凋亡无能为力 ［34］ 。说明了Bax，Bak诱导Cyt C的释放机制和Bik，Bid并不相同。Bax在细胞内的时候以单体形式存在，但是经过凋亡因素的刺激后在细胞内的线粒体片断上发现的是Bax的同源二聚体形式，而且Bax的N末端区域位于Bax单体的内部，当去除了Bax的N末端后在没有凋亡因素的刺激下也可以发现Bax的重新分布 ［35］ 。由此可以得出凋亡刺激因素改变了Bax的结构导致了Bax的聚合和与线粒体膜的结合，但是这两步中哪一步发生在前面尚不得而知。虽然有实验表明，当Bax形成二聚体时，可以形成类似阴离子通道样结构。但是没有证据表明单纯的Bax蛋白通道存在。也有实验发现Bax在线粒体膜上可以和F 0 F 1 -ATPase/H + 泵相结合，参与了Cyt C的释放，在去除了F 0 F 1 -ATPase中组成成分ATP4的细胞中，Bax就失去了诱导Cyt C释放的作用 ［36］ 。对于BH3-only的成员来说，其诱导Cyt C释放的机制仍不明了，尽管有实验表明Bid可以直接影响线粒体膜中的脂质成分引发Cyt C的释放，亦可以引起Bax向线粒体的移位或者可以稳定Bax或Bak有利于后者发挥作用，从而行使Bcl-2家族成员中凋节因子的作用 ［30，36］ 。
综上所述，尽管人们已经认识Cyt C的释放在于细胞凋亡过程中具有重要意义，但是对于其具体的释放机制仍然需要进一步的研究。对于Cyt C释放通道以及释放的调节因素，Bcl-2家族成员的了解，会为我们进一步干预细胞凋亡过程提供更多的切入点。
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作者单位:450014河南郑州大学第二附属医院神经外科