维胺酯治疗痤疮的疗效观察及实验研究

    【摘要】 目的 观察维胺酯治疗痤疮的临床疗效，并从分子水平上探讨维胺酯对雄激素受体的影响。方法 治疗组口服维胺酯，并设对照组，卡方检验;体外培养角朊细胞并用维胺酯处理，后用Northern杂交及Western杂交分别检测处理前后的该细胞雄激素受体的mRNA及蛋白质的表达水平。结果 治疗组的显效率及总有效率均高于对照组（P<0.05），体外细胞培养的角朊细胞用维胺脂处理，其雄激素受体的mRNA及蛋白质的表达水平均下降，并与药物浓度有关。结论 维胺酯治疗痤疮有显著疗效，实验结果提示其疗效与下调细胞雄激素受体有关。

    关键词 维胺酯 痤疮 雄激素受体 蛋白质印迹法 RNA印迹法

    Observation and experimental study of the  efficacy of viaminati on acne

    Yang Wenjun，Cao Qiubo

     The General Fire Station Hospital of Chongqing，400011.

    【Abstract】 Objective To investigate the clinical therapeutical effect of androgen receptor.Methods Two hundred and eighteen cases of ances were allocated to the therapy group and control at radom;therapy group was treatˉed by oral viaminati with topical lotio sulfuris;control group was treated by oral minocycline，respectively.The treatˉment lasted for four weeks.In laboratory the effect of viaminati on the expression of the mRNA and protein of androgen receptor were examined through colo-16cells in vitro.Results The effective rate and total effective rate of viaminati for acne were higher than those in control group.Conclusion The laboratory research shows that therapeutical effect of viaminati for acne may be related to its down regulation on expression of androgen receptors in keratinocytes.Key words viaminati acne androgen receptor northern blotting wesern blotting  

    正常人毛囊皮脂腺单位均存在雄激素受体（androgen receptor，AR）的表达，皮脂腺的基底细胞和腺细胞及毛囊皮脂腺导管基底层细胞和基底层以上角朊细胞有高浓度的AR表达 ［1，2］。研究发现，痤疮患者皮损部位的AR水平高于皮损周围皮肤和正常对照，且受体的浓度不受血清性激素水平的影响 ［3］。另一方面，维A酸类药物在治疗痤疮方面疗效显著，并推动制药工艺不断改进。因此，我们选用三蕊胶囊（25mg/cap维胺酯）治疗痤疮患者以观察其临床疗效。并同时进行实验研究，即用不同浓度的维胺酯处理培养的Colo-16细胞，然后应用Northern及Western杂交分别检测处理前后细胞AR的mRNA及其蛋白质的表达水平，以探讨维胺酯的临床疗效与AR分子表达量变化的关系。

    1 资料与方法

    1.1 临床应用

    1.1.1 一般资料 病例选自门诊确诊的痤疮患者120例，有典型的临床症状和体征，痤疮病型分类按通用痤疮9级分类标准，即:（1）少量粉刺（<25个）;（2）中等量粉刺（25～50个）;（3）粉刺伴炎性丘疹（<25个）;（4）粉刺伴炎性丘疹及少量脓胞（<25个）;（5）大量粉刺（>25个）伴少量丘疹脓胞（<25个）;（6）中等量脓胞丘疹（25～50个）伴粉刺;（7）大量脓胞丘疹（>50个）伴粉刺;（8）炎性结节囊肿伴少量丘疹脓疱（<25个）;（9）炎性结节囊肿伴较多丘疹脓疱（>25个）。入选治疗前1个月内未接受过抗生素、性激      素、皮质类固醇，维A酸类药，过氧化苯甲酰等药物的治疗。共120例，男50例，女70例，年龄16～35岁，平均年龄25岁，病程5天～4年，按随机分配原则分为治疗组及对照组。

    1.1.2 治疗方法 治疗组口服重庆华邦制药有限公司生产的三蕊胶囊（每丸含维胺酯25mg）1丸，每日3次，连服4周为一疗程。对照组口服美满霉素50mg，每日2次，连服4周为一疗程，两组皮损处均外涂硫磺制剂。

    1.1.3 疗效判定 连续用药一疗程后判定疗效。病情下降3组以上为显效，下降2组为有效，下降1组为微效，等组无变化为无效。

    1.1.4 统计学方法 卡方检验。

    1.2 实验研究

    1.2.1 角朊细胞培养及维胺酯处理 人角朊细胞株COLO-16由日本北里大学Hikarus博士惠赠。用含15%胎牛血清的完全RPMI-1640培养液培养于100ml培养瓶中，37℃，5%CO 2 ，待细胞在培养瓶中达到60%左右的融合单层时，分别加入用RPMI-1640稀释的维胺酯，使维胺酯浓度分别为2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml。培养24h后，按常规方法消化、洗涤、收集、然后稀释于RPMI-1640中，备Northern杂交使用。   

    1.2.2 Northern杂交 根据文献 ［4］  的方提取细胞总RNA，取2μg经甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，常规转膜，80℃真空干燥2h，备NORTHERN杂交用。    AR cDAN（质粒按常规方法提取，用ECORI和BAMHI酶切）控针长540bq。取100ng该片段DNA，采用随机引物标记试剂盒（美国promeag公司）及a-32p-dctp（北京亚辉生物工程公司），参照试剂盒说明书标记探针。按文献 ［5］  进行预杂交、杂交、洗膜及放射自显影。当AR控针进行杂交完毕，按文献 ［5］  把膜上的探针洗去。同法，改用β-actin探针进行杂交。放射自显影片用图像处理分析系统（IBAS.0/KONTRONGERMANY）对杂交带进行光密度扫描，检测信号强度。

    1.2.3 Wenster杂交 细胞总蛋白质用Folin酚法定量 ［6］  后，计算出各样品浓度，根据样品的蛋白质浓度，计算100μg蛋白质所需的样品体积。按文献 ［5］  进行SDS-PAGE。膜经封闭后依次与一抗（鼠抗AR单抗，美国AYMED公司）、二抗（生物素标记抗鼠IgG）及三抗（亲合素标记碱性磷酸酶）于20℃温育及漂洗，经相应底物色后摄相记录结果。

    2 结果   

    2.1 临床疗效 治疗组总有效率74.55%，显效率为44.55%;对照组总有效率为35.19%，显效率为23.15%，经统计学处理，两组总有效率差异均有非常显著性（P均<0.01）。两组疗效，见表1。表1 两组疗效 例（略）

    2.2 实验研究

    2.2.1 Northern杂交 1组为对照组，2、3、4、5、6组经维胺酯处理过，终浓度分别为2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml及30μg/ml，其AR的mRNA光密度值与相应β-actin的mRNA光密度值之比分别为:1202.97/2170.21（1组）、977.83/1316.31（2组）、213.37/1586.34（3组）、214.29/3027.50（4组）、66.42/3137.13（5组）、53.19/2848.49（6组），其比值从大至小为2→1→3→4→5→6顺序。提示维胺酯可降低角朊细胞中AR的mRNA含量，并与药物浓度有关。

    2.2.2 Western杂交 1组为对照组，2、3、4、5为维胺酯处理过，终浓度分别为5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml。其中AR蛋白质的光密度值分别为1919.45（1组）、1429.30（2组）、1316.90（3组）、830.32（4组）大小顺序分别为:1>2>3>4>5，提示维胺酯可降低角朊细胞中AR蛋白质含量，并与药物浓度相关。

    3 讨论

    雄激素在痤疮的发病中起着重要作用 ［7，8］  且这种作用是通过与AR作用而发挥的。研究发现，痤疮的发生与毛囊皮腺单位AR水平升高或AR对正常血清水平的雄激素的敏感性增加有关 ［9］  。这部分解释了雄激素在痤疮发病中的重要作用与只有极少数患者的血清雄激素水平升高 ［10］这一事实的矛盾。另一方面，维A酸可以通过其核受体（RAR/RXR）调控多种特定基因的转灵活性。考虑到维A酸类药物治疗痤疮的临床疗效，推测维A酸下调AR的mRNA途径或蛋白质的表达水平似有可能，幸运的是，该推测得到了本次实验结果的支持。由于皮脂腺合成/分泌旺盛及皮脂腺导管的异常角化是痤疮的重要病理表现 ［11，12］  ;AR在毛囊皮脂腺单位及皮肤角朊细胞的广泛分布，因此，该实验结果提示维A酸类药物抑制皮脂腺细胞的增殖、抑制皮脂腺的增生及抑制皮脂腺导管的异常角化与其下调AR的作用有关。由于角朊细胞不同于皮脂腺细胞;体外培养的环境不同于表皮/真皮单位中的环境，因此，有必要进一步检测痤疮患者在经维A酸类药物治疗后，其皮损中的AR表达的变化情况。

    参考文献

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