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Expression and its correlation with lymph nodes metastasis of vascular endothelial growth factor-C（VEGF-C）and vascular endothelial growth factor receptor-3（Flt-4）in non-small cell lung cancer
Zheng Xiaohua，Zhao Wei，Zhang Peiyi，et al.
202Hospital of PLA，Shenyang110003.
【Abstract】 Objective To study the gene expression of vascular endothelial growth factor C（VEGF-C）and vascular endothelial growth factor receptor-3（Flt-4）in non-small cell lung cancer and their relation with pathologˉic features.Methods S-P immunohistochemical staining was used to detect the expression of VEGF-C and its reˉceptor Flt-4in10neighboring noncancerous tissue and60NSCLC cases of non-small cell lung cancer and32lymph nodes cases with lymph nodes metastasis of non-small cell lung cancer.Results The difference of positive expression rate of VEGF-C and Flt-4in NSCLC and paracancer tissues and lymphatic node metastasis was signifiˉcant（P<0.05）respectively.A positive correlation was found between VEGF-C and Flt-4in lung cancer cell（P<0.05）.The expression of VEGF-C of NSCLC correlated with the TNM stages（P<0.05）.The expression of VEGF-C and Flt-4of NSCLC was closely related to lymph node metastasis（P<0.01P<0.01）.VEGF-C，Flt-4had no relation to the histological type and pathologic grade.The microvessels of positive Flt-4in lymphatic node with metastasis were higher than that in lymph node without metastasis.The difference is significant（P<0.001）.Concluˉsion VEGF-C，secreted by lung cancer cells，up-regulates the expression of Flt-4in NSCLC and takes its effect via Flt-4receptors in cell membrane by autocrine.It contributes to the genesis of NSCLC.VEGF-C and Flt-4are highly expressed in NSCLC，have close relation to lymph node metastasis and results in lymphatic metastasis in lung cancer.Key words lung cancer vascular endothelial growth factor vascular endothelial growth factor receptor-3 lymphatic metastasis
肿瘤细胞通过淋巴管扩散是其主要的生物学特性之一。长期以来，由于缺乏特异性淋巴管内皮细胞生成因子和标记物，因此，对肿瘤细胞发生淋巴转移相关机制的研究受到限制。近年发现的血管内皮生长因子C ［1］ （VEGF-C）是血管内皮生长因子（VEGF）家族的一个新成员，可特异性 地激活淋巴管内皮上的血管生长因子受体Flt-4，因此认为VEGF-C具有促进淋巴管生成并在肿瘤细胞淋巴转移中起主要作用。本实验旨在研究VEGF-C及其受体Flt-4在NSCLC中的表达，探讨其与淋巴转移等临床病理特征的关系。
1 材料与方法
1.1 一般资料 标本来源于我院及中国医科大学第一附属医院1998年1月～2003年10月手术切除的并经病理证实的原发性NSCLC患者60例，其中男46例，女14例;平均年龄56.2岁。伴有肺癌转移的淋巴结32例。另取10例癌旁肺组织做为对照组。标本经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，制成4μ厚的切片。分别行HE和免疫组织化学染色。所有患者术前均未接受过化疗或放疗等任何治疗。按国际抗癌联盟（UICC）1997年修订的P-TNM标准分期:Ⅰ期19例，Ⅱ期15例，Ⅲ期23例，Ⅳ期3例。
1.2 试剂与方法 兔抗VEGF-C多克隆抗体和SP试剂盒、DAB等免疫组织化学试剂均购自北京中山生物公司（美国Santa Cruz和Zymed公司产品）。Flt-4多克隆抗体（美国Santa Cruz公司产品）等购自武汉博士德公司。免疫组织化学方法按链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶连接（SP）法试剂盒说明书步骤进行。一抗工作浓度:抗VEGF-C为即用型工作液，抗Flt-4为1∶100。应用pH6.0柠檬酸缓冲液作为抗原修复液加热修复抗原。DAB显色，苏木素复染，脱水、中性树胶封片。用PBS代替一抗作为阴性对照。
1.3 结果判定 VEGF-C和Flt-4阳性表达主要定位于肺癌细胞胞质内，呈棕黄色颗粒。先于100倍光镜下选择免疫染色浓集的区域观察5个视野，然后在400倍视野下计数每个视野100个细胞，最后取5个视野中阳性细胞平均百分数作为每张切片的结果，阳性细胞数占癌细胞总数>10%为阳性。Flt-4阳性微脉管计数方法:先在100倍光镜下确定5个着色最密集的区域，然后在200倍视野下计数5个热区中Flt-4阳性微脉管数，取平均值。肿瘤区内单个或成丛的内皮细胞，无论成腔与否均视为脉管计数，伴有肌层的脉管不予计数。
1.4 统计学方法 数据用SPSS10.0统计软件包，进行χ 2 检验、t检验及Kendall相关分析完成统计学处理。
2 结果
60例NSCLC中VEGF-C阳性率为58.3%（35/60）。阳性染色主要定位于肺癌细胞胞质内（图1），在肺癌间质及癌旁正常肺泡中无表达，癌旁支气管粘膜上皮细胞及鳞状化生上皮细胞胞质中可见VEGF-C蛋白弱表达，阳性率10%（1/10），VEGF-C的表达在NSCLC和癌旁组织的差异有统计学意义（P<0.05）。NSCLC中Flt-4阳性率为71.7%（43/60），阳性染色主要定位于肺癌细胞及间质的淋巴管内皮细胞胞质中（图2），癌旁正常支气管和肺泡中无表达，癌旁间质的部分淋巴管内皮细胞胞质中可见弱表达，阳性率20%（2/10），Flt-4的表达在NSCLC及癌旁组织差异有非常显著性（P<0.01）（见表1）。转移的淋巴结中癌细胞VEGF-C、Flt-4的表达与癌旁比较差异有非常显著性（分别P<0.001，P<0.001），与NSCLC比较差异有显著性（分别P<0.005，P<0.05）。两种蛋白在淋巴结转移组和非转移组的原发NSCLC中的表达差异有非常显著性（分别P<0.01，P<0.01）。VEGF-C在TNM分期两组间的表达差异有显著性（P<0.05）。VEGF-C、Flt-4的表达与组织类型、病理分级均无关（均P>0.05）。（表1）。VEGF-C与Flt-4在NSCLC中的表达呈正相关（P=0.023）（表2）。Flt-4阳性微脉管数在淋巴结转移组为19.59±4.56，未转移组为14.35±3.42。经t检验两组差异有非常显著性（P<0.001）（表3）。 表1 NSCLC组织中VEGF-C与Flt-4蛋白表达与临床病理特征之间的关系（略）注:与癌比较，（1）P<0.05，（2）P<0.01;与癌旁组比较，（3）P<0.001;与Ⅰ～Ⅱ期组比较，（4）P<0.05;与淋巴结转移组比较，（5）P<0.01 表2 非小细胞肺癌组织中VEGF-C、Flt-4 蛋白的表达及相关性分析（略）
3 讨论
VEGF-C是一种高度特异的血管内皮细胞有丝分裂原，具有刺激血管和淋巴管生成的双重作用，通过与其特异性受体（VEGFR-2/Flt-4）结合，引起一系列的信号转导，在多种肿瘤的生长、发展及转移中起着重要的调节作用。VEGFR-2主要分布在血管内皮细胞，Flt-4在胚胎发育早期血管中有广泛的表达，但在胚胎发育后期和出生后仅局限于发育中的淋巴管内皮细胞中有表达 ［2］ 。在同一组织中VEGF-C结合Flt-4的亲和力比结合VEGFR-2的亲和力高3倍多 ［3］ 。因此，VEGF-C和Flt-4成为淋巴管生成的重要信号转导通路。有资料显示，VEGF-C具有促进肿瘤细胞生长的作用。国外的研究发现多种肿瘤细胞表达VEGF-C，如前列腺癌、肺癌、胃癌、乳腺癌等 ［4～7］ 。本实验VEGF-C及Flt-4阳性率明显高于癌旁组织，并且，两种蛋白的表达呈显著正相关。研究结果提示NSCLC中VEGF-C水平上调，是由肺癌细胞分泌，并通过自分泌方式作用于细胞膜上的Flt-4受体，推测VEGF-C上调了Flt-4的表达，与非小细胞肺癌的发生有一定关系。VEGF-C的表达与肿瘤的TNM分期正相关。同时发现，随着肿瘤的分化程度降低VEGF-C表达虽有增高趋势，但无统计学意义。VEGF-C、Flt-4的表达与组织类型无关。
对32例转移的淋巴结组织中癌细胞进行染色结果显示VEGF-C及Flt-4表达与原发NSCLC及癌旁组织比较差异有显著性。提示高度表达VEGF-C及Flt-4的癌细胞发生了转移。研究中发现2例患者其VEGF-C蛋白在有转移的淋巴结中癌细胞表达阳性，而原发肺癌细胞中为阴性表达，提示可能分泌VEGF-C的癌细胞具有较强的淋巴管侵袭能力，导致癌细胞发生了淋巴结转移。在NSCLC中，有淋巴结转移组VEGF-C、Flt-4表达明显高于无淋巴结转移组，差异有显著性。因而提示我们在NSCLC中，VEGF-C旁分泌作用于淋巴管内皮细胞上的Flt-4受体，发挥其生物学效应，促进肿瘤细胞淋巴结转移。进一步说明VEGF-C及Flt-4与介导肺癌组织中异常淋巴管形成及肺癌淋巴结转移密切相关。国外学者也曾研究报道，VEGF-C通过激活改变淋巴管内皮的生物学活性，分泌某些细胞因子，对肿瘤细胞产生了趋化作用，可促进肿瘤的淋巴结转移 ［8］。
国外学者Yonemurat ［9］ 等研究了胃癌VEGF-C和Flt-4的表达，证实VEGF-C主要是由癌细胞产生，Flt-4阳性淋巴管数量与VEGF-CmRNA表达水平、淋巴侵袭程度和淋巴结转移有关。本研究发现Flt-4阳性微脉管数在淋巴结转移组NSCLC间质中明显增高，进而证实由肺癌细胞分 泌产生的VEGF-C具有促进淋巴管生成作用。此外，淋巴 管内皮细胞相互间缺乏紧密连接及其基底膜的不完整性，导致淋巴管通透性增高，也是肿瘤细胞易进入淋巴管发生转移的原因之一。综上所述，NSCLC中VEGF-C和Flt-4的表达增高，与肺癌的发生及发展有关，与淋巴管增生及淋巴转移关系密切，可作为肺癌患者判断淋巴转移的估计指标之一。目前国外已把阻断VEGF-C与Flt-4之间的结合及信息传递作为治疗肿瘤的靶向，为抑制肿瘤淋巴转移提供了一种新途径。（本文图片见封三）
参考文献
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8 Karkkainen MJ，Makinen T，Alitalo K.Lymphatic endothelium:a new frontier of metastasis research.Nat Cell Biol，2002，4（1）:2-5.
9 Yonemura Y，Fushida S，Bando E，et al.Lymphangiogenesis and the vasˉcular endothelial growth factor receptor（VEGFR）-3in gastric cancer.Eur J Cancer，2001，37（7）:918-923.
作者单位:110003辽宁沈阳解放军第202医院综合科（院部， 病理科）