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关键词 动物促生长剂 一代实验 大鼠 生殖系统 发育
Exploration of the effect of animal feed-additive on the reproductive function of rats
Li Jun，Li Xiaomei，Zhang Chunling，et al.
Maternity and Child-Care Institute，Public Hygiene College of Shangdong University，Shangdong250012.
【Abstract】 Objective The objetive of the present study was to investigate the potential effects of animal feed additive which was used to promote growth on part of reproductive function of female rats.Methods In this study，we selected Wistar rat as studied object，and one-generation（rat were fed died with feed-additive，and the pups were maintained the same diets until puberty）experiment.Then we observed various doses of feed-additive’s effects on adolescent rat body，detected rats serum hormone concentrations and so on.Results Compared with control group caused obvious changes in F 1 generation rats in one-generatin experiment.（1）The VO age of rats in the lower dose group became significantly younger in comparison to that of the control group（P<0.05）.（2）F 1 generation female rats:uterus/body weight ratio and ovary/body weight ratio increased remarkably and showed significant difference beˉtween the lower dose group and control group;（3）weight ratio，there was a positive correlation beween the two groups（r=0.815，P<0.01）;（4）serum FSH concentrations markedly increased in high dose group than in control group（P<0.05）.（5）F 1 generation female rats:the weight of testis and epididymides decreased gradually with the increasˉing of the feed-additive.Serum FSH concentration also decreased in high dose group control group（P<0.05）.Conˉclusion Animal feed-additive may probably play weak estrogenic activity，and may accelerate puberty development of famale rats.Feed-additive can affect hypothalamic-gonado axis in some certain，and its effect of accelerating puˉbertal development is not through the axis system，but through reproductive tract directly.With the increasing of the feed-additive，F 1 generation rats reproductive organ/body weight ratio show significant change.Red blood cell count results suggest that feed-additive may not develop androgen-like action.In addition，feed-additive can affect hyˉpothalamic-pituitary-gonadolaxis reproductive，but through reproductive tract directly.
Key words animal feed-additive one-generation experiment rat reproductive system development
有专家怀疑动物促生长剂的使用与越来越多的儿童性早熟有关，长期接触使用促生长剂的食物可能会提前儿童青春期发育。但目前这只限于一种猜测，国内外都尚未见到有关于促生长剂使用与儿童发育方面的流行病学和动物实验学研究。因此，我们曾进行了促生长剂的短期动物实验，为进一步探讨促生长剂是否能够促进大鼠生殖系统早发育，研究其作用的相关机制，我们设计了一代动物实验。从而为今后进一步研究促生长剂对人体早发育的影响奠定基础。为降低环境激素的负面影响提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验用促生长剂 购自目前市场上正在流行使用的动物生长素添加剂。饲料:对照组，用山东大学实验动物中心制备的普通饲料;低剂量组，在普通饲料的基础上添加0.2%的促生长剂;高剂量组，在普通饲料的基础上添加2%的促生长剂。
1.1.2 实验用Wistar大鼠 由山东大学实验动物中心提供，动物合格证号为鲁动质200001003，实验设施合格证号为980120。选用9周龄健康雌性大鼠36只，体重平均为（223.81±11.40）g，随机区组法分为三组，分别为对照组、低剂量组、高剂量组，每组12只。大鼠分别以分组饲料喂饲2w后，与健康雄性Wistar大鼠按照雌雄比为1:2的比例同笼饲养、交配，观察、判断雌鼠受孕后，将雌性孕鼠单笼喂养，继续饲以特制饲料，直至仔鼠于21d龄断乳，按组内平均体重±5g选出45只/组/性别，继续与母鼠相同的暴露，直至实验结束。雌鼠处死时间为42d龄，雄鼠处死时间为53d龄。
1.2 一般状况 每天观察动物活动、饮食情况，及时发现有无异常生病、受伤或死亡，同时注意大鼠皮肤、呼吸、神经系统功能及行为方面的改变。
1.3 雌鼠阴道开口情况观察 29d龄，开始观察，每天记录各组阴道已开口的大鼠数。
1.4 雌鼠动情周期的检测 35d龄开始观察，HE染色技术，连续每天做阴道涂片 ［25］ ，统计各组已经进入动情期的大鼠数。
1.5 血清学指标 断头处死大鼠，常规取血分离出血清，用放免法测定血液雌二醇E 2 、睾酮T、促卵泡成熟素FSH及黄体生成素LH的水平，并当天做红细胞计数。
1.6 雌鼠过氧化物酶活性测定 大鼠处死后，迅速剥离子宫、卵巢，称重。称重后快速取子宫组织0.1g，低温下进行过氧化物酶活性测定。
1.7 雄鼠生殖器官称重 雄鼠在处死后，取睾丸、附睾、前 列腺称重。
1.8 统计学方法 用SPSS for windows10.0统计分析。
2 结果
2.1 雌性大鼠的阴道开口时间 见表1。
表1 一代实验中仔代雌鼠的阴道开口情况 （略）
由表1可以看出:在大鼠30d龄时，使用了促生长剂的大鼠阴道开口数明显多于对照组，差异呈现出显著性（P<0.05），到青春发育后期，各组之间差异就没有显著性。
2.2 动情周期观察结果 见表2。
表2 一代实验末仔代雌鼠的动情周期观察 （略）
表2显示:从亲代开始接触促生长剂，仔代雌鼠在42d龄时已经进入动情周期的大鼠数比不接触促生长剂的仔代雌鼠数显著增多（P<0.05）。2.3 激素水平 见表3，表4。
表3 一代实验末仔代雌鼠的激素水平 （略）
注:与对照组相比， ˇ P<0.05
表4 一代实验末仔代雄鼠的激素水平 （略）
注:与对照组相比， ˇ P<0.05
表3，4显示:仔代雌鼠在未进入青春期（35d龄）时，所测激素E 2 及FSH水平在促生长剂低剂量组和高剂量组与对照组之间差异均无显著性（P>0.05）。到仔代雌鼠42d龄时，高剂量组大鼠的FSH水平与对照组相比有显著升高（P<0.05）。仔代雄鼠到42d龄时，FSH水平较对照组有显著降低，其它时期及其余测定激素在各组间未见差异。
2.4 脏器增长结果 见表5，表6。
表5 一代实验中仔代雌鼠青春期的脏器重量 （略）
注:与对照组相比， ˇˇ P<0.01
表6 一代实验中仔代雄鼠青春期的脏器重量 （略）
注:与对照组相比， ˇ P<0.05
而表5、6显示:仔代雌鼠在长时间接触低剂量的促生长剂后，卵巢、子宫重量比对照组有极显著性增长（P<0.01），而高剂量组与对照组比较则没有差异。在仔代雄鼠脏器重量结果中，与对照组相比，低剂量的睾丸重量明显增加（P<0.05），而高剂量组附睾重量则明显降低。前列腺重量在三个组之间没有显著差异。
2.5 脏体比比较结果 考虑到动物脏器的重量受体重的影响较大，我们又对动物的脏体比进行了比较。见表7，8。
表7 一代实验中仔代雌鼠青春期的脏体比结果 （略）
注:与对照组相比 ˇˇ P<0.01，与对照组相比， ˇ P<0.05
表8 一代实验中仔代雄鼠青春期的脏体比结果 （略）
注:与对照组相比 ˇˇ P<0.01，与对照组相比， ˇ P<0.05
表7，8显示:从亲代就开始摄入使用促生产剂食物的仔代雌鼠在青春期时子宫、卵巢脏体比在低剂量组有显著性的升高，高剂量组子宫脏体比较对照组有升高，但未达到要求的统计学显著性水平。仔代雄鼠在青春发育期时的脏器重量在考虑了体重之后，发生了一些变化，对照组的脏体比最高，低剂量组次之，而高剂量组最低，这种趋势在睾丸、附睾和前列腺中均有体现。高剂量组大鼠睾丸体重比与对照组相比有显著性降低（P<0.05），高剂量组大鼠的附睾重量比对照组有极显著降低（P<0.01）。
2.6 雌性大鼠子宫过氧化物酶活性测定结果 见表9。表9显示:在一代实验中长时间接触促生长剂后，子宫过氧化物酶活性显示出了与子宫脏体比相同的趋势，即低剂量组与对照组之间差异出现显著性（P<0.05），高剂量组较低剂量组有所降低。
表9 一代实验末仔代雌鼠的过氧化物酶活性 （略）
注:与对照组相比， ˇ P<0.05
2.7 子宫脏体比与过氧化物酶之间的相关关系分析 对子宫/体重与子宫过氧化物酶进行相关分析得出:二者的相关系数r=0.815，P<0.001，二者有显著相关性。
2.8 外周血红细胞计数 对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组大鼠外周血红细胞计数结果各组之间差异未发现显著性（P>0.05）。
3 讨论
大鼠发育到一定时期，随着体内激素水平的升高，青春期开始发育。目前，国外一些研究以阴道开口时间作为雌性大鼠青春期发育的生物标志，研究环境内分泌化合物对青春期发育的影响。有大量的实验结果认为环境激素类物质在一定剂量时可以提前或推迟阴道开口时间 ［1～4］ 。雌激素的食物对生殖系统产生明显的毒副作用，且有累积性和时间相关性 ［5］ 。本研究结果与基本支持上述观点，自开始观察阴道开口时至大鼠青春期，使用促生长剂的实验组阴道开口的大鼠数一直多于对照组，并且在大鼠青春发育前期，低剂量组与对照组开口的大鼠数差异出现极显著性（P<0.01），高剂量组与对照组差异也有显著性（P<0.05），表明促生长剂具有一定的雌激素样作用，能够促进阴道开口时间提前，使部分大鼠提前进入青春期。但显示的结果并不是剂量越高，开口提前越明显，考虑原因可能几个方面:（1）环境雌激素的一个可能的作用机制是在低浓度时作为ER的激动剂，而高浓度时作为ER的拮抗剂。（2）促生长剂在低剂量时即可以对肝脏产生损害，随着剂量升高，损害作用加大，影响了其它系统的发育。（3）可能由于大鼠的个体差异所致。
下丘脑-垂体-性腺轴是调节性腺分泌性激素的一个重要的体系，一般认为该系统的发动引起了生殖系统的快速生长，出现第二性征的发育。
在大鼠，35d时龄处于青春发育期前，45d龄时处于青春发育期，55d龄则青春期发育基本完成 ［6］ 。因此，正常情况下，当大鼠35d时，大鼠不应该出现青春期发育。但在本次实验中，当大鼠达到30d龄时，接触促生长剂的大鼠多数已经出现阴道开口，呈现青春期征象，而此时这些大鼠体内的E 2 浓度与对照组相比并没有提高，说明大鼠青春期开始发育可能并不是通过该轴系统，而是直接作用于生殖道。有文章报道，环境雌激素类化合物与内源性雌激素（17β-E 2 ）相似，可与E 2 竞争雌激素受体 ［7］ ，生殖系统组织细胞有较多的雌激素受体-几乎为其它组织的10倍，因此，生殖系统组织细胞首先受到植物性雌激素的影响 ［2］ 。而后在大鼠42d龄时，高剂量组雌鼠血中FSH水平比对照组有显著提高，下丘脑-垂体-性腺轴开始发动，而仔代雄鼠血中FSH水平较对照组有显著降低，提示促生长剂可能干扰了下丘脑-垂体-性腺轴的作用，对大鼠的内分泌系统产生影响。有文章报道外源性雌激素使生物体内E 2 水平升高，T水平下降 ［3，4］ 。对此尚需要有更多更进一步的研究。
子宫生长实验 ［4］ 是最早建立的检测雌激素活性的方法，目前仍被广泛应用。本实验采用了经口一代实验，实验中，低剂量组仔代雌鼠的子宫、卵巢及子宫/体重、卵巢/体重与对照组相比差异均出现显著性，提示该促生长剂很可能有弱雌激素活性。
一般认为外源性雌激素通过雌激素受体介导的通路发挥作用 ［5］ 。本实验中低浓度的促生长剂表现出了雌激素样作用，但随着促生长剂剂量的增加，大鼠生殖器官增重并不是明显的直线上升的表现，长时间接触高剂量促生长剂大鼠的生殖器官增重甚至比对照组有显著降低，高剂量组的大鼠阴道开口时间、动情周期结果及过氧化物酶活性与低剂量组相比都有降低，表现出抗雌激素样作用，与前人的研究结果一致。有人认为环境雌激素与ER结合形成ER-复合物，丧失了刺激ER和蛋白质合成的作用，取代了完整的雌激素反应。因此他们具有抗雌激素的特征。对于环境雌激素抗雌激素样作用的机制，还需要进一步加以探讨 ［4～6］ 。雌激素或雌激素样化合物作用于子宫时，可引起子宫产生大量的糖原、磷酸酯酶、过氧化物酶等，其中过氧化物酶对雌激素或有雌激素活性化合物的作用为特异性应答 ［4～6］ 。过氧化物酶的含量和活力可反映化合物的雌激素活性及其强度。本实验结果表明:低剂量的促生长剂有较强的使过氧化物酶活性增强的作用。就子宫脏器系数与POD活性进行了分析，子宫脏器系数与POD活性之间有显著相关性，进一步证实促生长剂的性激素样作用，可以考虑把它作为一项评价化合物雌激素活性的指标。
关于环境雌激素对雄性大鼠生殖器官的作用，目前有一些报道 ［7，8］ 。本实验中，雄性大鼠生殖器官的脏体比随着接触促生长剂剂量的升高而降低，高剂量组与对照组比较差异出现显著性，说明促生长剂可能会影响未成年雄性大鼠生殖器官的发育，干扰或延迟雄鼠生殖系统发育的过程。雄激素具有促进外周血红细胞增生的作用，本研究结果表明，促生长剂喂养后，各组大鼠外周血红细胞计数差异均无显著性，各组计数之间也无一定的规律性，说明促生长剂可能没有雄激素样作用，不能刺激红细胞的生长发育，但 仍需进一步的研究证实。
由于不同类型的环境雌激素在环境中大量存在，人们经常同时接触多种环境雌激素，因此，有可能存在着促生长剂与其它化合物之间的联合作用，另外一些植物性雌激素还具有拟雌激素和抗雌激素的双重作用，这就更增加了其对机体的危害作用及作用机理的复杂化，而现阶段人们对各环境激素之间在体内外的联合作用很不清楚，这说明了将来研究任务的艰巨性，但也无疑给我们提出了今后的研究方向。另外，通过食物链受环境激素（促生长剂）影响的生物被人所食用后，对人体产生的影响有待于进一步研究。
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作者单位:250012山东大学公共卫生学院妇女儿童保健研究所