用荧光原位杂交技术对性腺发育不全患者性染色体分析的研究

  【摘要】 目的 探讨荧光原位杂交（FISH）技术比常规染色体分析，在性腺发育不全患者性染色体检测中的优越性。方法 应用CEP，Xp11.1-q11.1（绿色标记）及CEP，Yq12SatelliteⅢ（红色标记）DNA探针，对30例常规染色体分析有性染色体异常者，行单色或双色FISH对比分析。结果 25例核型一致，符合率83.33%。5例不一致，其中1例45，X0/46，X，i（Xq），嵌合比例倒置。3例有Y染色体，但无Y荧光信号。1例47，XYY（女性），出现45，X0/46，XY/47，XYY三种核型嵌合。以上FISH结果，更符合临床体征。结论 FISH检测性腺发育不全患者性染色体异常，比常规染色体分析更准确、可靠，有一定临床实用意义。

　　关键词 荧光原位杂交 常规染色体分析 性腺发育不全 性染色体异常

　　Study on sex chromosome analysis of gonad agenesis patients with FISH   Li Yuzhong，Liu Yanqiu，Wang Zhanghua，et al.

    Jiangxi Provincial Women and Children Hospital，Nanchang330006.

　　【Abstract】 Objective To study the advantages of dual-color fluorescence in situ hybridization（DIFH）in sex chromosome analysis of gonad agenesis patients over traditional chromosome analysis.Methods Analysed30casˉes of sex chromosome abnormalities found by traditional chromosome analysis with single or dual-color FISH of green-labelled CEP，Xp11.1-q11.1and red-labelled CEP，Yq12satelliteⅢDNA probes.Results The karyotypes of25cases are the same as traditional method，with the agreement rate being83.33%.The results of other five cases were different.One was45，X0/46X，i（Xq），with reverse mosaic，Three cases had Y chromosome but without Y fluoˉrescence signal.One was47.XYY（female），with the mosaic of45，X0/46，XY/47，XYY.The results of FISH were more consistent with clinical features.Conclusion FISH analysis of sex chromosome abnormalities of gonad agenesis patients is more accurate and reliable than traditional chromosome analysis，it has better practicalbility. 

　　Key words FISH traditional chromosome analysis gonad agenesis sex chromosome abnormality  

　　在人类遗传病研究中，性别发育有异常是常见的遗传病，发病率为1%～2% ［1］  ，性的分化是由性染色体决定的。性染色体无论在数量及结构发生任何改变，均可导致性腺发育不全，因此性染色体是决定性别的基础。荧光原位杂交（FISH）是当今迅速发展起来的分子生物学与细胞遗传学、免疫学相结合的新技术。它不仅可检测中期分裂相，同时还能在间期细胞中显示杂交信号 ［2］  。本研究为观察FISH技术比常规染色体分析，在性腺发育不全患者性染色体异常检测中的优越性，现报告如下。

　　1 资料与方法

    1.1 一般资料 选2003年6月～2004年6月，因原发性或继发性闭经，反复流产，不孕不育，无精症，生殖器及性腺发育不全来本院门诊就诊，经常规染色体分析为性染色体异常者，或核型与临床体征不一致者共计30例。1.2 方法

    1.2.1 染色体标本制备 采用外周血细胞培养，常规G显带制片与分析，根据国际细胞遗传学命名体制（ISCN） ［3］  进行核型分析。同时留部分细胞悬液置-20℃冰箱保存备用。

    1.2.2 FISH的制备 （1）杂交前预处理:取外周血细胞悬液滴片→气干→干热→2×ssc温育30min→70%、85%、100%乙醇梯度脱水，每次2min。（2）探针变性:取JAB杂交液7ul，加JAB-X（DXZ1）（Xp11.1-q11.1，绿色标记）及JAB-Y（DYZ1）（Yq12SatelliteⅢ，红色标记）DNA探针各1μl（中美合作上海集爱遗传与不育诊疗中心提供）。加1μl dH 2 O混合置73℃水浴变性5min→置冰中。（3）玻片变性:玻片置70%变性液中变性2min→冰乙醇系列脱水→干片待用。（4）杂交将5μl杂交混合液滴在杂交区内→盖上玻片→橡胶泥封片→置37℃杂交仪中过夜。（5）杂交后清洗:移去橡胶泥→置0.5×ssc液洗涤7min→置PBS中清洗3次，每次2min→DAPI复染→封片。（6）在荧光显微镜下用三色滤光片观察结果，每份标本计数200个间期细胞，3～5个染色体中期分裂相。

　　2 结果

    2.1 30例性腺发育不全患者常规染色体G显带及FISH两种检测方法的比较 见表1。

　　表1 30例性染色体异常患者常规染色体及FISH对比分析结果 （略）

　　2.2 性腺发育不全患者染色体异常部分FISH图片 （1） 47，XYY（女性）标本，双色FISH见间期核及中期分裂相显示，有1绿及1绿1红与1绿2红3种不同类型荧光信号。（2）47，XXX标本双色FISH显示，见间期核及中期分裂相有2绿1红荧光信号。（3）47，XXX单色FISH显示，间期核及中期分裂相均有3个绿色荧光信号。（4）45，X0/46，X，i（Xq），间期核显示1个及2个绿色荧光信号，中期分裂相有2个绿色荧光信号，其中1条X长臂等臂染色体在绿色荧光信号中央区见横形裂隙。见图1～4。

　　3 讨论

    3.1 FISH检测性染色体嵌合型异常比常规染色体分析结果更准确可靠 常规染色体分析只能观察占比例少的中期分裂相，判断的准确程度，完全依赖中期分裂相的数量与质量，因此有一定的局限性。而FISH技术除可分析中期分裂相外，还可分析占比例多的间期细胞。尤其是在极短的时间内，对分散及显带欠佳的分裂相，以及部分显带技术不易分辨的异常，均可做出准确判断。如一些倒位、微小缺失、复杂畸变等 ［4］  ，弥补了常规染色体分析中的不足。本研究通过30例性发育不全患者，常规染色体及FISH两种方法对比分析。有25例核型一致，符合率占83.33%。有5例结果不致:其中（1）1例核型为45，X0/46，X，i（Xq）的嵌合体。常规染色体分析，46，X，i（Xq）的中期分裂相比45，X0的中期分裂相数目多。而FISH分析，45，X0的细胞数比46，X，i（Xq）的细胞数多，出现嵌合比例倒置。本例患者由于45，X0的细胞数占多数，因此临床表现更符合Turner综合征（见序号3）。（2）2例45，X0/46，XY两性嵌合核型，常规染色体分析有Y染色体存在，但FISH检测无Y荧光信号。本2例患者临床表现为女性性腺发育不全，可能与 Yq12信号缺失及同时存在45，X0的细胞嵌合有关（见序7、 8）。（3）1例常规染色体分析为47，XYY，社会性别为女性患者。FISH分析为45，X0/46，XY/47，XYY三种核型的嵌合，患者不具备典型47，XYY综合征的临床表现，而是两性畸形，这大概与体内存在3种不同类型的嵌合核型有关（见序11）。（4）1例46，XY（小Y）无精症男性，常规染色体分析有Y染色体，FISH无Y荧光信号（见序号16）。考虑本例无精、不育，与Yq12缺失有关。符合Y染色体长臂缺失，可影响精子的生成。精子的发生基因位于Yq11.23至Yq12邻接区域之间的报道 ［5］  。以上5例FISH分析比常规染色体分析更符合临床体征。

    3.2 FISH技术对观察染色体微小畸变比常规染色体分析更清晰直观 本文从2例45，X0/46，X，i（Xq）中期分裂相，FISH图中清晰可见。在1条X长臂等臂染色体近着丝粒，荧光信号中央区有一横形裂隙。将着丝粒分成两半，形成2个等大，对称的荧光小点。分别附着在2个X长臂等臂染色体近着丝粒上，这一现象在常规染色体分析中很难看清楚。而在FISH图中能更清晰、直观可见。以上结果，符合X长臂等臂染色体的形成机制。是在着丝粒区出现横裂，短臂缺失，长臂复制而成的报道 ［6］  。

    以上研究说明:FISH技术检测范围广，特异性强，能准确定位，易检出占比例小的嵌合体及微小缺失，染色体畸变等。比常规染色体分析更准确可靠。对性发育不全患者性染色体异常的检测，诊断及指导治疗，均具有重要的临床实用意义。由于FISH技术受探针特异性的限制，只能使用已知位点探针。同时价格较昂贵，作为常规检测方法尚存在一定的困难。在研究性发育不全患者性染色体异常时，应首选常规染色体分析，发现异常而又不能确诊的病例，再采用FISH检测方法加以证实。因此，FISH不能完全取代常规染色体分析，只有两者适当地结合，才能取得更理想的临床实用效果。（本文图片见封三）

　　参考文献

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　　作者单位:330006江西省妇幼保健院