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in prostatic stroma cells
Shi Jiandang，Zhang Zhisong，Wu Quan，et al.
Bioactive Materials Key Lab of Ministry of Education，
Institute for Molecular Biology，Nankai University，Tianjin300071.
【Abstract】 Objective To study the role of p15in the TGFβ1induced differentiation and growth arrest in prostatic stroma cells.Methods Prepare the eukaryote expression construction pEGFP-IRES2/p15and the small interference dsRNAs（SiRNA）target to p15mRNA.Transfect them into cultured prostatic stromal cells.Using MTT and semi-quantity RT-PCR to analysis the the effect of p15over-expression or knock-down in TGFβ1inducing proliferation and differentiation in prostatic stromal cells.Results Over-expression of p15gene remarkably inhibits the proliferation of cultured prostatic stromal cells，but does not increase the mRNA for smoothelin.The SiRNA of p15can dramatically decrease the level of p15mRNA and partly neutralize the proliferation and differentiation effects caused by TGFβ1.Conclusion TGF-β1can induce growth arrest by up-regulation of p15，but p15may not diˉrectly take part in the pathway through which TGF-β1induces the expression of smoothelin.It might indirectly enˉhance the differentiation of fibroblasts to smooth muscle cells by keeping them in the G1phase of cell cycle，which provides a state favorable to the fibroblasts in response to the differentiation signals.
Key words benign prostatic hyperplasia TGFβ1 p15 SiRNA
良性前列腺增生症（benign prostatic hyperplasia，BPH）是最常见的老年男性泌尿疾病。前列腺增生大部分表现为基质增生，而平滑肌细胞的增殖是基质增生的主要病理改变之一。我们以前的研究证明，在体外培养的前列腺基质细胞中0.1～10ng/ml的转化生长因子β1（TGFβ1）可抑制前列腺基质细胞增殖，促进平滑肌细胞的表型，在这一过程中，细胞周期蛋白依赖性激酶4的抑制因子p15的表达明显升高 ［1］ 。本研究拟探讨p15在TGFβ1促进平滑肌细胞分化和抑制细胞增殖中的作用。
1 材料与方法
1.1 构建p15基因真核表达质粒pIRES2-EGFP/p15 用RT-PCR方法从前列腺基质细胞中扩增p15基因的完全编码序列，克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP（Clontech公司），用酶切和测序鉴定克隆片段插入方向和序列的正确性，用超纯质粒纯化试剂盒QIAGEN Plasmid Mini Kit提取用于转染的重组质粒。
1.2 制备p15SiRNA 用QIAGEN公司的在线设计软件设计针对p15基因mRNA的SiRNA模板，正义链为5′--TCC AGG TCA TGA TGA TGG GCA CTA TAG TGA GTC GTA TTA，反义链为5′-AAT GCC CAT CAT CAT GAC CTG CTA TAG TGA GTC GTA TTA，对照组SiRNA模板参照文献 ［2］ 设计，分别为5′-AAG GAC ACA GTC TAC ACG GAC CTA TAG TGA GTC GTA TTA和5′-AAG TCC GTG TAG ACT GTG TCC CTA TAG TGA GTC GTA TTA，T7Promoter序列为5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG，SiRNA模板中下划线部分为和T7Proˉmoter互补的序列。参照文献 ［3］ ，使用promega体外反转录试剂盒合成SiRNA。
1.3 前列腺基质细胞的原代培养 取自经耻骨上前列腺摘除术切除的前列腺标本经胶原酶消化后用本实验室建立的前列腺基质细胞培养条件进行培养 ［4］ ，用3～5代的细胞进行试验。将细胞分别按照5×10 4 /孔和1×10 4 /孔接种6孔板和24孔板，在原培养液中贴壁过夜，换无血清的ITS（Invitrogen/Gibco公司）培养液继续培养24h。
1.4 按照如下分组向孔板中转染pIRES2-EGFP/p15或SiRNA （1）对照组;（2）转染pIRES2-EGFP/p15质粒组;（3）转染对照质粒pIRES2-EGFP组;（4）共转染p15质粒+p15SiRNA组;（5）共转染p15质粒+对照SiRNA组;（6）添加TGFβ1（5ng/mL）组;（7）添加TGFβ1（5ng/mL）并转染p15SiRNA组;（8）添加TGFβ1（5ng/mL）并转染对照SiRNA组。转染采用QIAGEN公司Effectene Transfenction Reagent试剂盒，试验操作按照说明书进行。每组3孔，继续培养。
1.5 用TRIZOL试剂提取RNA 6孔板细胞在培养24h后用Invitrogen公司的TRIZOL试剂提取RNA，随机引物法反转录后，以β 2 微球蛋白和GAPDH为内对照，PCR扩增后经1%的琼脂糖电泳，用紫外凝胶成像系统对进行电泳条带光密度分析，用半定量测定细胞p15基因和平滑肌细胞特异性基因Smoothelin ［5］的表达情况。
表1 所用引物 略
1.6 用MTT法测定细胞增殖状况 24孔板细胞在培养48h后用MTT法测定细胞增殖状况。
2 结果
2.1 增加p15基因的表达水平 构建的p15表达质粒经酶切和测序鉴定插入方向和序列正确，将其转染细胞后能明显增加p15基因的表达水平;用p15SiRNA转染细胞后可以显著的抑制p15mRNA的水平（图1A、1B）。但是它们对Smoothelin的mRNA水平无明显的影响（图1C、1D）。
2.2 TGFβ1可以促进p15和Smoothelin基因的表达 p15的SiRNA可以显著抑制TGFβ1引起的p15表达升高，部分中和TGFβ1对Smoothelin基因表达的上调作用（图2）。
2.3 MTT试验结果 转染p15表达质粒能够抑制体外培养的前列腺基质细胞的增殖，p15的SiRNA能够逆转这种抑制作用;5ng/ml的TGFβ1也可抑制前列腺基质细胞的增殖，p15的SiRNA能够中和这种抑制作用（图3）。
3 讨论
本实验室在研究前列腺增生基质病变分子机制的过程中，发现雌二醇可明显刺激转化生长因子（TGF-β）的表达，而TGF-β1能够促进平滑肌细胞的表型。提示雌二醇可以通过刺激TGF-β1的表达促进平滑肌细胞的表型 ［6］ 。
TGFβ1是前列腺中的一种多功能的调节因子。越来越多的证据显示，TGFβ1在良性前列腺增生发病过程中具有重要作用，其作用的分子机制并不明确 ［7］ 。在我们以前的实验中发现，高浓度的TGFβ1（1～8ng/ml）可以促进体外培养的前列腺基质细胞中Smoothelin的表达，抑制细胞的增殖;Lee Chung等的实验表明，TGFβ1在0.1～10ng/ml时可以抑制前列腺基质细胞的增殖，促进p15的表达，但不影响功能类似的p16和p27基因的表达 ［1］ 。p15是近年来新发现的抑癌基因，它通过与CDK4和CDK6结合发挥作用，抑制细胞增殖。一般认为
，处于频繁分裂期的细胞很难对细胞外的信号产生应答，发生分化或者逆分化。因此抑制细胞的增殖p15基因的表达可能与TGFβ1促进前列腺平滑 肌细胞表型有关。
本实验结果表明，p15质粒引起的基因过表达能够明显抑制前列腺基质细胞的增殖，并且用SiRNA“Knock down”p15基因的表达能够中和TGFβ1的抑制细胞增殖的作用，提示:p15在TGFβ1抑制细胞增殖中有重要作用。而转入p15表达质粒的细胞中Smoothelin mRNA的水平没有发生明显的变化，但用SiRNA抑制了p15的基因时，可部分降低TGFβ1对Smoothelin mRNA的上调作用，推测尽管p15并不直接参与TGFβ1促进平滑肌细胞表型的调控，但是它可能通过将细胞周期抑制在G1期，为细胞应答TGFβ1的促分化信号提供了一个有利的时相。
（本文图片略）
参考文献
1 Wei Zhou，Irwin Park，Michael Pins，et al.Dual regulation of proliferaˉtion and growth arrest in prostatic stromal cells by transforming growth factor-β1.Endocrinology，2003，144:4280-4284.
2 Bertrand JR，Pottier M，Vekris A，et al.Comparison of antisense oligonuˉcleotides and siRNAs in cell culture and in vivo.Biochem Biophys Res Commun，2002，296:1000-1004.
3 Donz O，Picard D.RNA interference in mammalian cells using siRNAs synthesized with T7RNA polymerase.Nucleic Acids Research，2002，30:46.
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6 Zhang J，Park I，Cheng Y，et al.Estradiol enhances TGFb1expression and its secretion level in human prostatic stromal cells.Journal of Uroloˉgy，2002，212.
7 Huang X，Lee C.Regulation of stromal proliferation，growth arrest，difˉferentiation and apoptosis in benign prostatic hyperplasia byTGF-beta.Front Biosci，2003，8:740-749.
基金项目:国家自然科学基金资助项目（编号30271297）
作者单位:1 300071天津南开大学分子生物学研究所生物活性材料教育部重点实验室（ △ 责任作者）
2 300170天津市第三中心医院泌尿外科