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The research on determine condition of fluorescence intensity in confocal laser scanning microscopy
Chen Yue，Yang Jianru，Zhao Baohong，et al.
The Medical and Pharmaceutical Analysis Center，Peking University，Beijing100083.
【Abstract】 Objective To explore the conditions under which fluorescence intensity is determined in confocal laser scanning microscopy.Methods The parameters of confocal laser scanning microscopy were set and the effects of these modifications on the response of the fibro-conglutination albumen and type I collage
n of human gingival fibrobˉlasts on indirect immunityfluorescence were observed，and the fluorescence intensity of the effects was measured.Reˉsults After the cells grafted on the material surface，the fluorescence dye intensity of the fibro-conglutination albuˉmen had no notable difference in materials of the four groups，the alter of the chemistry component of the material surˉface had no notable influence on the formation of the fibro-conglutination albumen.But the effects of the type I collaˉgen were different in materials of the four groups.Conclusion Setting appropriate conditions for the determination of fluorescence intensity in confocal laser scanning microscopy is important in the analysis of the true results of experiˉment.Key words confocal laser scanning microscopy fluorescence intensity
激光扫描共聚焦显微镜（confocal laser scanning miˉcroscopy，CLSM）是20世纪80年代发展起来的目前世界上最先进的分子细胞生物学分析仪器。它是在荧光显微镜基础上加装了激光扫描装置，使用紫外或可见激光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，较传统显微镜有着不可比拟的优越性 ［1］ ，已广泛应用于分子细胞生物学、生理学、病理学、免疫学、药理学、遗传学等领域，成为这些领域新一代强有力的研究工具，对生物样品进行定性、定量、定时和定位研究具有很大的优越性
。
1 材料与方法
1.1 实验用样品 分四组。Ti组:未涂层的对照组;HA组:应用离子束辅助沉积技术在种植体表面沉积羟基磷灰石HA涂层;TCP/HA组:应用离子束辅助沉积技术在种植体表面沉积磷酸三钙/羟基磷灰石TCP/HA复合涂层;RGD组:应用化学方法在纯钛表面共价接枝生物活性肽RGD（Arg-Gly-Asp，精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸）。样品规格:直径10mm，厚2mm的圆盘形，表面粗糙度Ra值均为0.1μm。
1.2 实验步骤 （1）接种到材料表面的细胞分别培养3、24和48h后，PBS轻轻冲洗3次。（2）4%福尔马林固定10min，PBS冲洗。（3）0.1%（V/V）Triton X-100渗透5min，PBS冲洗。（4）1%的羊血清阻断20min。（5）分别用下列抗体37℃孵育1h:①兔抗人FN多克隆抗体（1:30稀释，Sigma）;②兔抗人I型胶原多克隆抗体（1:30稀释，Sigma），PBS冲洗3次。对照组一抗用无荧光的兔血清。（6）用TRITC标记的羊抗兔IgG（1:30稀释，Sigma）37℃孵育1h，PBS冲洗3次。（7）激光扫描共聚焦显微镜（Leica TCS-NT，Germany）取图，每个试样随机选择30个细胞测量细胞荧光强度。取图条件:①激发光波长:567nm，②扫描方式:xyz，③物镜:40倍干镜（NA为0.75），④激光功率:（20±2）mw，⑤扫描强度:50%，⑥光电倍增管的增益（PMT）:852，⑦探测针孔:2.02，⑧扫描次数:4。
1.3 统计学方法 实验结果用SPSS10.0for Windows软件包处理，单因素方差统计分析，P<0.05时具有统计学差异。
2 结果
2.1 细胞外基质FN的形成 四种材料表面细胞的胞浆内都可见到红色的FN荧光染色。在细胞核的周围染色较深，有较强的荧光强度，细胞胞浆的四周荧光强度逐渐降低。说明FN产生的部位位于细胞浆内，其形成量在核周较多，而胞浆的外围逐渐减少。定量对比四种材料表面细 胞FN的生成量，显示在检测的各个阶段差异无统计学意义（P>0.05）（见表1）。
表1 材料表面细胞FN生成量的荧光强度比较 （略）注:所有结果组间比较，P>0.05
2.2 I型胶原的形成 在细胞接种后3h，钛和RGD表面的细胞几乎没有I型胶原的分泌;TCP/HA表面可见红色较强的I型胶原荧光染色区，分布在细胞的胞浆内，细胞核无染色;HA材料表面也可见红色荧光阳性染色区，但没有TCP/HA的染色重。荧光强度比较结果显示，HA和TCP/HA组的荧光强度比Ti和RGD组的大，差异有统计学意义;TCP/HA比HA表面的荧光强度大，差异有统计学意义（P<0.05）;Ti和RGD组之间比较差异无统计学意义（P>0.05）。 细胞培养至24h，可见四种材料表面都有红色的I型胶原阳性染色，分布在细胞核周围的胞浆内。定量比较四组间的细胞分泌I型胶原的荧光强度，显示TCP/HA组比Ti组高，差异有统计学意义（P<0.05），其他各组间差异无统计学意义（P>0.05）。随着培养时间的延长，各组材料表面细胞分泌的I型胶原含量逐渐增加，至48h，各种材料之间I型胶原的荧光染色强度差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。
表2 三组材料表面细胞I型胶原生成量的荧光强度比较 （略）注: ˇ 为同Ti组相比，P<0.05， ˇˇ 为同Ti组相比，P<0.01; △ 为同HA组相比，P<0.05; ## 为与RGD相比，P<0.01
3 讨论
3.1 激光扫描共聚焦显微镜的原理及功能 激光扫描共聚焦显微镜利用激光扫描束经照明针孔形成点光源，对标本内焦平面上的每一点扫描，标本上的被照射点，在探测针孔处成像，由探测针孔后的光电倍增管（PMT）逐点或逐线接收，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像，照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的。焦平面的点同时聚焦于照明针孔和探测针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面，克服了普通荧光显微镜图像模糊的缺点。另外在显微镜的载物台上加一个微量步进马达，可使载物台沿着Z轴上下移动，将样品各个层面移到照明针孔和探测针孔的共焦面上，样品的不同层面的图像都能清楚地显示，成为连续的光切图像，实现了“光学切片”（Optical sectioning）的目的。激光扫描共焦显微镜的功能主要分为两大类，即图像静态采集和动态扫描。其中图像静态采集又可分为多荧光探针标记样品的图像采集，无损伤连续光学切片图像的采集，即“细胞CT”，三维图像重建，荧光强度定量分析。图像的动态扫描功能可分为xyt、xyzt和xt扫描，即观察细胞内离子动态变化，荧光漂白恢复（FRAP），荧光能量共振转移（FRER）等。其中荧光强度的定量是一项非常重要的功能。3.2 荧光强度的定量在生物医学中的作用 由于多数荧光探针对被标记物的标记均为特异性标记，即荧光探针的亮度即荧光强度可以反映被标记物相对含量的多少。因此利用这一功能可以对单个细胞或细胞群的溶酶体、线粒体、 DNA、RNA和受体分子含量、成份进行定量测定。还可测定诸如膜电位和配体结合等生化反应程度。此外，还适用于高灵敏度快速的免疫荧光测定，这种定量可以准确监测抗原表达，细胞结合和杀伤及定量的形态特性，以揭示诸如肿瘤相关抗原表达的定量信息。由于荧光强度的定量在生物医学中起着如此重要的作用，因此对进行荧光强度定量的样品测试就有非常严格的要求。进行荧光强度定量的样品测试条件如下。
3.3 对样品制备的要求 一个好的开端是成功的一半，样品制备的好坏更是荧光定量的关键之一。对要求进行荧光强度定量的样品，如来源为组织，应采用冰冻切片，可以减少非特异性的荧光信号。如来源为培养的细胞，为了不将细胞压扁，盖玻片与载片之间用甘油与PBS混合液（9:1）封片。甘油还具有抗荧光淬灭的作用。为防止仪器在设定取图条件时对样品产生的荧光淬灭发生，在样本制备时，最好做好各样品的平行样。
3.4 仪器各参数的选择及要求 进行荧光强度定量的样品，在图像获取时，要求各样品的取图参数值保持一致。具体相关参数如下。
3.4.1 物镜（Objective） 物镜是成像质量关键要素之一。荧光进入物镜的通透量的多少与物镜的光透射率有关，而物镜的光透射率与数值孔径（NA）的4次方成正比，与物镜的放大倍数的平方成反比，因此应尽量选择高数值孔径的物镜，即通常应选择油镜或水镜。
3.4.2 激光功率（Laser Pwr） 表示激光器的输出功率，通常激光功率越大，图像的信噪比越好，但样品荧光越容易被淬灭，所以激光功率通常要尽可能的小。
3.4.3 激光扫描程度（Scan Str） 设置用来扫描样品的激光强度占激光器输出功率的百分比，其大小选择应综合考虑激光输出功率、荧光染料的发光效率、样品中荧光染料的浓度、荧光染料的光漂白率决定。除此之外，还应考虑PMT电压，扫描步长，扫描点数。对于发光效率高，样品荧光染料浓度高，荧光漂白率低的样品，可选择较高的扫描激光强度。
3.4.4 探测针孔（Pinhole） 探测针孔越大，进入光检测器的信号（发射荧光）越多，信噪比越好，但样品的成像厚度也越厚。如果要进行被标记物的精细定位，探测针孔应尽可能的小。通常探测针孔设置为1Airy单位（Airy盘是指点状光源衍射的图案的中央光斑），探测针孔数值<1时，分辨率较好，探测针孔数值>1时，信噪比较好。但当荧光信号非常弱时，可适当增大探测针孔。要想提高图像质量，还可以同时增加取图的重复扫描次数。
3.4.5 光电倍增管（PMT） 设定加在PMT上的电压。PMT上加不用的电压将使检测器的灵敏度不同，电压越高，则光信号转换成的电信号越强，如荧光强度较低，则选择较大的电压。反之，选择较小的电压。
3.4.6 扫描速度（Scan speed） 扫描速度越慢，图像信噪比越好，但也越容易发生光漂白，通常选择仪器的标准扫描速度即可。
3.4.7 重复扫描次数（Average） 激光在样品一扫描点的重复照射次数。在样品的某一扫描点，通过声光控制器控制激光多次照射扫描点，取多次照射的平均荧光强度。多次照射同一扫描点可极大的减少躁声，提高信噪比。因而可以测量荧光暗淡模糊的样品，有效地提高荧光图像的质量。由于汇聚光斑的直径很小，样品中其它点受到极少的光照射，因而减少了对非扫描点光漂白和光损伤。但多次扫描同一点，可能会对该扫描点带来一定的荧光漂白效应和光损伤。而且要花费更多的时间。因而可根据不同的荧光染料及检测量变化的快慢加以选择。
3.5 荧光强度的定量的影响 应用激光扫描共聚焦显微镜对用间接免疫荧光法检测改性后的材料表面对人牙龈成纤维细胞分泌细胞外基质纤粘连蛋白FN和I型胶原的影响进行荧光强度的定量:牙龈成纤维细胞在材料表面的铺展和附着过程需要细胞外基质的参与，其中包括纤粘连蛋白FN和I型胶原的形成和分泌。细胞首先通过与材料表面吸附的细胞外基质的相互作用粘附在材料表面。材料表面的性质对细胞外基质的分布和沉积有影响 ［2］ 。细胞粘附在材料表面后又通过材料的刺激分泌细胞外基质，促进细胞的进一步粘附。纤粘连蛋白FN和I型胶原是成纤维细胞分泌的两种主要细胞外基质蛋白。纤粘连蛋白是一个具有粘附功能的糖蛋白，可以结合细胞表面的受体和其他的 细胞外基质，如胶原。纤粘连蛋白和细胞之间的相互作用能促进细胞的粘附、铺展和迁移。I型胶原是人体内最多的蛋白成分，也是组成结缔组织的主要结构蛋白。胶原能控制细胞的形态、细胞分化和其它生物学功能 ［3］ 。I型胶原和纤粘连蛋白之间的特定反应对结缔组织结构的形成和维持具有重要作用。由于细胞外基质的形成量是衡量其功能的指标，也是组织预后的指征，因而检测细胞外基质的合成量可作为生物材料生物学潜能的判断依据 ［4］ 。细胞在材料表面接种后FN的荧光染色强度在四组材料之间没有显著差异，说明材料表面化学成分的改变对FN的形成没有明显影响。但四组材料对I型胶原分泌的影响有差异。细胞培养后3h，两钙磷涂层材料表面I型胶原的荧光强度明显高于未涂层组，TCP/HA表面I型胶原量的荧光强度明显高于RGD组，差异有统计学意义。在细胞培养后24h，TCP/HA涂层材料表面I型胶原的荧光强度明显高于未涂层组，但其他三组间差异不显著。这一现象说明RGD和钙磷涂层对钛表面人牙龈成纤维细胞的影响不同。在培养初期钙磷涂层材料刺激了细胞I型胶原的分泌，其中TCP/HA比HA刺激I型胶原分泌的作用大。RGD对其表面牙龈成纤维细胞分泌FN和I型胶原的影响不明显。我们在成纤维细胞的研究中发现，细胞密度与荧光强度有直接的关系。在一定范围内，细胞的荧光染色效果随细胞密度增高而减弱，细胞功能状态随细胞密度增加而增加。在一定的折中密度，细胞既有合适的荧光染色效果，又有足够的细胞活性，这个密度大约为10 5 左右。具体应根据不同细胞而有所调整。本文讨论了在激光扫描共聚焦显微镜中荧光强度的测定条件，特别是介绍了有关仪器参数的选择和设置，这些参数之间有着非常密切的关系，因此，在进行荧光定量分析时，对各个参数的选择应当综合考虑。此外，还要考虑所要测量的细胞的类型和大小、荧光染料种类及浓度等诸多因素。
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作者单位:100083北京大学医药卫生分析中心
北京大学口腔医学院