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Yang Guangmin，Duan Xuimei，Yang Mi，et al.
Central laboratory of Jilin Provincial Hospital，Changchun130021.
【Abstract】 Objective To probe into the cytotoxicity of CIK cells against tumor cells in vitro.Methods Lymphocytes cells were isolated freshly from peripheral blood of health donors by Ficoll-Hypaque density centrifugaˉtion，and the cells obtstained were induced by IFNγ，IL-2and CD3mAb.Phenotypes of CIK cells were analysed by FACS.Target cells were differentiated from effect cells by CFSE dying.The mortality of Target cells were determined by FACS.Results The phenotypes of CD3were expressed highly（88.03%）、CD3CD56（35.05%）.The expression of CD16were not increased.CIK cells possess the cytotoxicity against tumor cells of K562、HL-60、Hela、7721and A375.Conclusion IFN γ 、CD3McAb、IL-2can induced strong peripheral lymphocytes to produced CIK cells which exert highly efficient cytotoxic effects on tumor cells.
Key words CIK cytotoxicity FACS
过继免疫疗法是治疗恶性肿瘤的一个重要辅助治疗方法，而用于过继免疫疗法的免疫活性细胞必须具有较强的增殖力和细胞毒活性。CIK（cytokine-induced killer）细胞中主要效应细胞由于同时表达CD3、CD56两种膜蛋白分子 ［1］ ，而这种双阳性细胞来源于CD3 + CD56 - T细胞，而非CD3 - CD56 + NK细胞，它兼有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性的广谱杀瘤的优点 ［2］ 。故CIK细胞以其较强的细胞毒性和扩增性能而成为临床应用的一种理想效应细胞 ［3］ 。我们从健康人外周血单个核细胞中诱导大量CIK细胞，运用流式细胞术研究其生物学特性和体外杀伤肿瘤细胞的活性，为采用CIK细胞实施临床过继免疫治疗提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂 rhIL-2（长春长生基因药业股份有限公司），rhIFNγ（PEPRO TECH公司），抗CD3McAb（BD公司），IMDM及胎牛血清（Gibco公司），活体染料羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（carboxyfluorescein diacetate，succinimidyl ester，CFSE）（Molecular Probes USA公司）。碘化丙碇（PI）（Sigma公司），Ficoll淋巴细胞分离液（相对密度1.077±1g/L）为上海第二制药厂产品，藻红蛋白（PE）及异硫氰酸荧光素（FITC）标记的鼠抗人CD3、CD16、CD56单抗及同型对照IgG1/IgG1均为美国eBioscience公司产品。健康人外周血购自长春血站.
1.1.2 靶细胞 人红白病细胞株K562，人白血病细胞株HL-60，人宫颈癌细胞株Hela，人肝癌细胞株7721，人黑色素瘤细胞株A375均为本室传代冻存。
1.2 方法
1.2.1 CIK的诱导 依照参考文献 ［4］ 方法，将健康人外周血用Ficoll密度梯度制备单个核细胞悬液，调整细胞浓度至1×10 6 /ml，用含10%FCS的IMDM培养液进行培养，于培养第1天在体系中加入1000U/ml IFNγ，培养24h后加入300U/ml rIL-2，50ng/ml抗CD3McAb继续培养，每4天更换新鲜培养液，另补加rhIL-2、抗CD3McAb，最后调整细胞浓度至4.8×10 5 /ml，于第14天收获细胞用于表型分析和细胞毒试验。
1.2.2 CIK细胞的增殖测定 于诱导培养后第4、7、10、13、19、22天取CIK细胞悬液，用台盼蓝染色法进行计数，并除以初始细胞数，计算出实际扩增倍数，动态观察细胞增殖状况。
1.2.3 CIK细胞表型的分析 取诱导14天的CIK细胞，经PBS洗涤2遍后，各取1×10 6 /100μl置于falcon管中，分别加入20μl鼠抗人荧光素标记的CD3、CD16、CD56、CD3/CD56及同型对照IgG1/IgG1，4℃避光孵育30min，PBS洗涤2遍后流式细胞仪上机分析。
1.2.4 靶细胞的标记 K562、HL-60、Hela、7721和A375细胞作为靶细胞，在37℃，5%CO 2 条件下用终浓度为2.5μmol/L的CFSE标记10min。洗3次去除残余的染料，并悬浮于完全培养基中。
1.2.5 CIK体外细胞杀伤试验 实验用U型96孔板，设立实验孔和单独靶细胞孔，实验孔加入效应细胞（CIK细胞）和靶细胞（K562细胞、HL-60细胞、Hela细胞、7721细胞和A375细胞）各100μl，每孔均加6000个靶细胞，效靶比分别为25:1、12.5:1，设置3个平行复孔。120g离心2min。于37℃，5%CO2孵育4h。共孵育结束后，加入25μlPI（100μg/ml）置于冰浴5min，用流式细胞仪分析。
1.2.6 流式细胞仪的检测和分析 所有的标本用FACˉSCalibur（BD公司）分析，用CELLQuest获取和分析数据。FL1荧光通道检测CFSE的荧光强度，FL3荧光通道检测PI的荧光强度。先以CFSE阳性标记的靶细胞设门为R1（图1A），收集1000个靶细胞。在PI和CFSE双标记的散点图（图1B）中，进一步分析R1门中的靶细胞，其中PI和CFSE双标记的细胞（右上象限）为死亡的靶细胞（图1B），测量PI和CFSE双标记细胞的百分比（图1C）。靶细胞死亡百分比按公式计算:
特异性细胞毒百分率=实验组死亡的靶细胞（%）-自然死亡的靶细胞（%）100-自然死亡的靶细胞（%）×100
2 结果
2.1 CIK细胞的增殖分析 由图2可见，CIK细胞在诱导第0～7天时增殖比较缓慢，第14天细胞增殖100倍，在14～21天之间细胞处于快速增殖期，于第21天增殖曲线达到高峰约300倍。
2.2 CIK细胞表型分析 诱导14天的CIK细胞表型结果见表1。表1 诱导14天的CIK细胞表型分析 ˉx±s Numbers of CIK（%）CD3 88.03±5.01 CD16 8.50±3.10 CD56 30.11±2.23 CD16CD56 35.05±5.15
2.3 CIK细胞杀伤活性 诱导14天的CIK细胞对K562细胞和HL-60细胞、Hela细胞的杀伤作用较强，在效靶比为12.5:1、25:1对这三种细胞的杀伤没有明显差异，均达60%、50%左右;而CIK细胞对7721细胞和A375细胞的杀伤作用在效靶比为12.5:1、25:1的杀伤百分比分别为27.21%、25.13%、33.05%、29.72%，说明CIK细胞对7721细胞和A375细胞的杀伤作用不明显。见图3。
3 讨论
CIK细胞是将人外周血单个核细胞在体外经多种细胞因子诱导培养后获得的一种非MHC限制性的高效溶肿瘤细胞毒性T细胞。CIK细胞在正常人外周淋巴细胞中含量极少（仅1%～5%）在体外经细胞因子（如抗CD3McAb、IL- 2、IFNγ、IL-1α等）诱导培养后迅速增殖，较培养前增加1000倍以上。在诱导扩增中CD3单抗的作用是促进有丝分裂，而加入IFNγ、IL-1、IL-2则提高细胞毒活性 ［5，6］ ，因此保证了CIK细胞具有较好的扩增性能和较强的肿瘤杀伤活性，其中CD3 + CD56 + 双阳性细胞杀瘤活性高，杀瘤谱广，对多重耐药的肿瘤细胞同样敏感并能抵抗肿瘤细胞引发的调亡，而不影响骨髓造血功能，是目前最新、疗效最好的肿瘤免疫治疗。
CIK细胞的杀瘤机制 ［7，8］ :一是细胞表面粘附因子如LFA-1及ICAM-1在效应细胞识别靶细胞中发挥重要作用。二是CD3 + CD56 + 细胞可释放大量的具有细胞毒性的胞浆颗粒而对靶细胞发挥溶细胞作用。三是CIK细胞活化后分泌多种细胞因子，如IFN γ 、TNF、IL-2等，不仅对肿瘤有直接抑制作用，还可通过调节机体免疫系统反应性间接杀伤肿瘤细胞。此外，CIK细胞还可以诱导肿瘤细胞调亡，因为CIK细胞在培养过程中表达FasL，一方面增强了其对FasL + 肿瘤细胞引发的Fas-FasL调亡的抵抗性，还可以通过对Fas + 肿瘤细胞诱导调亡而行使其杀伤肿瘤的作用。由于CIK细胞CD16（IgG Fc受体）表达几乎不增加，CIK细胞可能无抗体依赖细胞介导的细胞毒作用 ［9］ 。CIK细胞虽然以CD3 + CD56 + T细胞为主要效应细胞，但却没有T淋巴细胞杀伤时的MHC限制性和非T细胞受体限制性 ［10］ ，对多种肿瘤细胞系（包括NK敏感的细胞株K562和NK不敏感的细胞株HL-60、Hela以及人肝癌细胞株7721，人黑色素瘤细胞株A375）均表现出不同的杀伤活性。
本研究在已建立的流式细胞术检测细胞毒方法 ［11］ 的基础上，体外培养5种不同肿瘤细胞，运用流式细胞术检测CIK细胞生物学特性和杀伤肿瘤细胞的活性。实验结果显示，CIK细胞经14天诱导后迅速增殖，CD3 +、CD3 + /CD56 + 表达增高，CD16表达几乎不增加，另外，其它活化表面标志如HLA-DR、CD25、CD69、CD28表达均增加，以及参与杀瘤机制的表面标志如CD54、CD11a、FasL也均有表达（另文发表），这足以证明我们所诱导的CIK细胞有大量扩增和较强的杀瘤活性。实验结果还显示，CIK细胞对不同肿瘤细胞均有杀伤作用，在效靶比25:1时，CIK细胞对K562细胞和HL-60细胞、Hela细胞的的杀伤作用没有明显差异，其杀伤百分率均达60%、50%以上，CIK细胞对7721细胞和A375细胞的杀伤作用不明显，这可能是7721细胞和A375细胞为帖壁细胞不能与效应细胞充分接触造成的，这仅仅是推测，其原因有待进一步探讨。
总之，CIK细胞能选择性杀伤肿瘤细胞，无严格的MHC限制性，对病毒感染细胞、恶性肿瘤细胞及异常的自体细胞有一定作用，而对机体毒副作用小，是肿瘤过继免疫治疗的新一代高效抗肿瘤效应细胞。
（本文图片见附页1）（略）
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ˇ 基金项目:卫生部属医疗机构临床学科重点项目（编号:20013145），吉林大学创新基金（编号:200103）
作者单位:130021吉林省人民医院中心实验室
130021吉林大学第一医院中心实验室
132001北华大学医学院免疫学教研室