两种局灶性脑缺血模型制作的比较研究

　　【摘要】 目的 研究比较两种局灶性脑缺血模型的制作。方法 制备大鼠大脑中动脉供血区梗塞模型，随机分为假手术组、永久性栓线组、栓线后2h再灌组，不同时段（0.5h、24h、48h）共9组，每组10只。SD雄性大鼠。结果 （1）存活率:永久性局灶脑缺血模型组存活率为40%;再灌局灶脑缺血模型组存活率为73.3%，而假手术组未见死亡。（2）神经功能缺失症状评分:永久性局灶脑缺血模型组与假手术组比较，手术后0.5h、24h、48h各组均P<0.01;再灌局灶脑缺血模型组与假手术组比较，手术后0.5h、24h各组均P<0.01，手术后48h组P<0.05;再灌局灶脑缺血模型组与永久性局灶脑缺血模型组比较，手术后0.5h、24h、48h各组均P<0.01。（3）病理检查:脑组织冰冻切片后，HE染色光镜下观测到:再灌流0.5h，缺血区有少许神经元肿胀，胞浆嗜伊红染色变浅，体积增大，形态变圆，神经元形态为扇形或角形。再灌流24h，可见胞核固缩深染，核仁消失，胞浆疏松，间质水肿。再灌流48h，脑组织水肿明显，有软化灶等病理改变。结论 再灌局灶性脑缺血模型动物死亡率低，梗塞效果恒定，且与人类脑卒中相似，更为实用。

　　Zhan Heqin，Ding Yuehong，Wu Lanou，et al.
   
　　Department of Pharmacology of Xiniang Medical College，Xiniang453003.
   
　　【Abstract】 Objective To comparatively study two model-making of cerebral infarction in the territory of middle cerebral artery in rats.Methods The models of cerebral infarction in the territory of middle cerebral artery were prepared in rats，the animals were randomly divided intonine groups each with10rats-sham-operated group，sustaining block group and transient cerebral ischemia-reperfusion group with different time phase（0.5h，24h，48h）.Results （1）Surviving rate:it is40%in the sustaining cerebral ischemia of middle cerebral artery in rats evˉery group，yet73.3%in transient cerebral ischemia-reperfusion group in each group;sham-operated group had no death.（2）Analysis of the neurological deficit examination:it has marked difference（P<0.01）in the sustaining cerebral ischemia of middle cerebral group as compared with sham-operated group in the different time phase（0.5h，24h，and48h）;similarly，it has also outstanding difference（P<0.01）in the transient cerebral ischemia and reperˉfusion group compared with sham-operated group at different time after surgery except for48h;it was significant（P<0.01）between the transient cerebral ischemia-reperfusion group and sustaining cerebral ischemia of middle cereˉbral group in the difference time phase（0.5h，24h，and48h）.（3）The brain was prepared with slices18μm frozen section，we cold know some situation when it was dyed.The brain was observed at reperfusion for0.5h，24h and48h after ischamia in rat.The structural damage of brain was found On the different degree.Conclusion The rat mortality is lower in transient cerebral ischemia-reperfusion model;this model was feasible，location fixed，high successful and alike human stroke.
   
　　Key words the model of middle cerebral artery occlusion transient cerebral ischemia sustaining cerebral isˉchemia rats
      
　　局灶性脑缺血模型的制作，国内外都有很多的方法和种类，但目前比较公认和研究较多的为颈内动脉线栓法 ［1，2］  制备的大鼠大脑中动脉血栓模型。此模型虽然有不开颅、手术时间短、缺血部位恒定等优点，但实际操作过程中死亡率仍然相当高，且永久性栓线和线栓后再灌两种模型又有极大差别。为此，本文对两种不同局灶性脑缺血模型进行比较研究，以期为脑缺血研究者提供一点信息和经验资料。
   
　　1 材料与方法
   
　　1.1 动物与分组 清洁级雄性SD大鼠90只，体重280～320g（昆明医学院重点实验室动物科提供）。随机分为假手术组、永久性栓线组、栓线后2h再灌组，不同时段（0.5h、24h、48h）共9组，每组10只。
   
　　1.2 模型制作 永久性脑缺血模型的制作 ［3］  :取大鼠，10%水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射麻醉，仰卧固定于手术台上，颈正中切开，分离右侧颈总动脉（CCA），颈外动脉（ECA），颈内动脉（ICA），用电凝器烧断ECA分支，结扎并游离ECA主干一段，在ECA近CCA分岔处打一松节并剪一“V”形口，将制备好的尼龙线由ECA的“V”形切口插入，经CCA分岔处通过ICA入颅至大脑中动脉，尼龙线插入深度为2.0～2.2cm（依大鼠体重而异），后系紧结扎线，大鼠约30min后清醒。于术后30min、24h、48h观察其神经功能缺失症状和死亡数。短暂性脑缺血模型的制作 ［3］  :和永久性脑缺血模型制作的前半部分相同，只是穿线成功2h后把尼龙线球端拉回ECA内进行再灌注，同样于大鼠术后30min、24h、48h观察其神经功能缺失症状和死亡数。
   
　　1.3 神经功能缺失症状评分 模型成功的主要指标是神经功能缺失症状评分 ［4］  ，手术后30min内大鼠清醒，此时可进行观察评分，分值越高，死亡率可能也越高，以后随着时间的延长，评分会缓慢降低，但两种模型差别很大。
   
　　1.4 脑组织病理检查 4%多聚甲醛固定脑组织6h，PBS 漂洗后入20%蔗糖PBS过夜，组织块下沉后于额极后6mm，9mm处作厚约18μm的冰冻切片，HE染色，光镜下观察。
   
　　1.5 统计学方法 对所得数据以均数（ˉx±标准差（s）表示，应用SPSS软件包，进行单因素方差分析并两两比较。

　　2 结果
   
　　2.1 存活率 永久性局灶脑缺血模型组大鼠手术后存活率为40%;再灌局灶脑缺血模型组大鼠手术后存活率为73.3%，而假手术组未见死亡。
   
　　2.2 神经功能缺失症状评分 永久性局灶脑缺血模型组与假手术组比较，手术后0.5h、24h、48h各组均P<0.01;再灌局灶脑缺血模型组与假手术组比较，手术后0.5h、24h各组均P<0.01，手术后48h组P<0.05;再灌局灶脑缺血模型组与永久性局灶脑缺血模型组比较，手术后0.5h、24h、48h各组均P<0.01（表1）。
   
　　表1 大鼠局灶性脑缺血不同模型术后各组神经功能缺失症状评分表 （略）
   
　　注:n=10， ˇ P<0.01， Δ P<0.05与假手术组比较; # P<0.01短暂脑缺血组与永久脑缺血组比较

　　2.3 脑组织病理观察 脑组织冰冻切片后，HE染色光镜下观测到:再灌流0.5h，缺血区有少许神经元肿胀，胞浆嗜伊红染色变浅，体积增大，形态变圆，神经元形态为扇形或角形。再灌流24h，可见胞核固缩深染，核仁消失，胞浆疏松，间质水肿。再灌流48h，脑组织水肿明显，有软化灶等病理改变。
   
　　3 讨论

　　如若阻断MCA的部位适当和控制一定的实验条件，能形成较为恒定的脑梗塞。用MCAO形成大鼠局部脑缺血的方法在国外早已公认，在我国也日益受到重视，并广泛应用于评价抗脑缺血药物的作用 ［4］  。
   
　　但是对此局灶性脑缺血模型的制作难度较大，死亡率较高，造成动物和耗材的很大浪费，在实践中我们将两种模型的制作加以比较，发现脑缺血再灌模型中动物的存活率较高，阻塞后不同时间神经缺失症状明显，完全符合脑缺血模型的制作要求，并可作为药效学的评价指标。
   
　　所有身体器官均能耐受一定的缺血时间，但脑组织对缺血缺氧十分敏感，长时间严重缺血可导致不可逆性脑细胞坏死，短暂性脑缺血可导致延迟性神经元死亡 ［5］  。永久 性局灶脑缺血模型使动物脑缺血时间过长，导致严重的脑水肿，压迫生命中枢，大部分死于呼吸抑制。而再灌局灶性脑缺血模型动物缺血时间较短，尽早恢复了血流，使动物的死亡率较低。然而，应考虑到脑组织富含卵磷脂，可伴有脑组织再灌注损伤，用此模型评价药物疗效时需加以考虑。这一点与临床上的脑缺血疾病治疗过程中的病理生理过程类似，有较高的实用价值。

　　参考文献
    
　　1 Belay V，Alonso FF，Busto R，et al.Middle cerebral occlusion in the rat by intraluminal suture.Stoke，1996，27（6）:1616.
   
　　2 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rat.Stroke，1989，20（1）:84-91.
   
　　3 柏顺明，冯忠堂，王廷华，等.大鼠大脑中动脉供血区梗塞的实用动物模型.昆明医学院学报，2001，22（4b）:99-101.
   
　　4 徐淑云，卞如濂，陈修，等.药理实验方法学.第三版.北京:人民卫生出版社，2002，1065-1066.
   
　　5 赵克森，金丽娟.病理生理学.北京:人民卫生出版社出版，1999，148-149.

　　ˇ 基金项目:云南省自然科学基金资助项目（No:2002C005M）

　　作者单位:453003河南新乡医学院药理教研室
   
　　　　　　　467000河南省平顶山市第一人民医院妇产科
   
　　　　　　　650031昆明医学院药理教研室（△神经生物所）