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Wang Xiaoping，Wang Liqing，Zhang Jun，et al.
College of Stomatology，Tongji University，Shanghai200072.
【Abstract】 Objective To explore the influence of Lanthanum Chloride on the TNF-αsecretion of human gingival fibroblast（HGF）induced by LPS.Methods Human gingival fibroblast was cultured by block methods.ELISA was used to analyse the TNF-αsecretion of HGF.Results The result of ELISA indicated the TNF-αsecreˉtion of HGF induced by LPS was inhibited significantly by LaCl 3 at1×10 -4 -1×10 -6 mol/L（P<0.05）.Concluˉsion The results suggested that there is some possible relevance of the influence of LaCl 3 on the release of inflammaˉtory cytokines with its resistance against inflammation.
Key words gingival fibroblast human Lanthanum Chloride TNF-α LPS
牙周炎是由细菌引起的感染性疾患，其发病机制与细菌及其毒性产物（包括细菌内毒素及细菌酶）的作用密切相关。细菌及其毒性产物可直接损伤牙周上皮及结缔组织，同时也可激活宿主的防御细胞，释放多种细胞因子、炎症介质，导致牙周组织继发损伤。这些炎症介质包括:白细胞介素（IL-1α，β，2，6，8）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、前列腺素E 2 （PGE 2 ）、花生四烯酸及其代谢产物等，它们都是强力的致炎物质，不仅有促炎作用，还可诱导骨组织脱矿、促进骨吸收。牙周炎的发生发展在很大程度上受这些因子影响。稀土是一组金属的简称，包括化学元素周期表第三副族中的镧系元素及性质与其相近的钪和钇。我国是稀土的主要产地，资源丰富。许多研究提示，稀土化合物有拮抗内毒素、抑制炎症因子和自由基产生及增强自然杀伤细胞和巨噬细胞功能等作用。本实验旨在探讨在脂多糖（LPS）介导下，氯化镧（LaCl 3 ）对人牙龈成纤维细胞（HGF）分泌与牙周炎相关细胞因子TNF-α的影响，希望为稀土用于口腔医学领域积累资料。
1 材料与方法
1.1 仪器、试剂 二氧化碳培养箱（Sanyo，Japan）、超净台（将来进化设备厂，江苏吴县），倒置光相差显微镜（Nikon，Japan），DMEM培养基（Gibco，Germany）、胰酶（上海化学试剂公司）、胎牛血清（杭州四季青公司）、角蛋白、波形蛋白单抗（Dako，Denmark）。酶标仪（Clinibio128，Austria），LPS（O 55:B 5 ，sigma，America），人TNF-αELISA试剂盒（深圳晶美公司），99%七水氯化镧（LaCl 3 ·7H 2 O，湖南省稀土金属材料研究所）。
1.2 HGF的原代培养 取因正畸减数或阻生拔除牙齿的健康牙龈，立即投入含三抗（青霉素、链霉素、庆大霉素）的D-Hanks液内，清洗组织块，将组织剪成1mm×1mm×1mm大小并移入25ml培养瓶中。倒置培养瓶于5%CO 2 、37℃培养箱中1h后，加入含10%胎牛血清与三抗的DMEM培养基，放入培养箱继续培养。隔日换液，至细胞长满瓶底80%，常规传代。绘制细胞生长曲线，计算倍增倍数，Enviˉsion免疫组化法鉴定细胞来源。选择四代至八代对数生长期细胞为实验对象。
1.3 检测 取四代至八代对数生长期HGF，0.25%胰酶消化制备细胞悬液，等量接种于96孔培养板，每孔200μl，放入二氧化碳培养箱培养。24h后弃上清液，分别加入（1）100μg/ml LPS;（2）DMEM培养基;（3）1×10 -4 mol/L LaCl 3 +100μg/ml LPS;（4）1×10 -5 mol/L LaCl 3 +100μg/ml LPS;（5）1×10 -6 mol/L LaCl 3 +100μg/ml LPS;（6）2μg/ml地塞米松+100μg/ml LPS。每组设三个复孔（MTT检测以上浓度LaCl 3 对细胞无毒性作用）。加药24h后吸取上清液，-20℃冰箱贮存。按ELISA试剂盒说明进行检测。
1.4 统计学方法 实验数据用SAS软件包（8.0版）处理，采用方差分析（Dunnett检验法）对各组均数与LPS组均数进行比较。
2 结果
LPS组HGF分泌的TNF-α比DMEM组多，二者差异有显著性（P<0.05）。三个含LaCl 3 组（1×10 -4 mol/L LaCl 3 +100μg/ml LPS、1×10 -5 mol/L LaCl 3 +100μg/ml LPS、1×10 -6 mol/L LaCl 3 +100μg/ml LPS）的TNF-α分泌量比LPS组低，差异有显著性（P<0.05）。地塞米松组TNF-α分泌也比LPS组低，差异有显著性（P<0.05）。见表1与图1。
表1 LaCl 3 对LPS介导HGF分泌TNF-α的影响（略）
注:与100μg/ml LPS组比较， ˇˇ P<0.05
图1 LaCl 3 对LPS介导HGF分泌TNF-α的影响（略）
3 讨论
TNF是近年来研究较深入的一种细胞因子，主要由巨噬细胞分泌，其他类型的细胞在一定条件下也能分泌TNF。目前发现TNF对诸多的组织器官有生物学效应，提示它可能是细胞因子网络中一个重要的多功能因子。
目前认为TNF-α对牙周组织的破坏机制主要为TNF-α能促进骨质吸收且可以介导其他牙周炎炎症因子的分泌。Bonavida等发现类风湿性关节炎患者关节滑液内TNF浓度增高，认为TNF可能有破骨细胞激活功能，能引起骨质吸收、抑制骨胶原形成 ［1］ 。Zhang D给Wistar大鼠注射TNF-α和IL-1可溶性受体，发现大鼠牙根吸收受抑制，提示这两种因子能诱导牙根吸收 ［2］ 。另有实验证明，TNF-α能诱导与牙周炎关系密切的IL-6、IL-8的生成 ［3，4］ 。
据文献报道，稀土元素有拮抗内毒素、抑制炎症因子分泌的作用。Deveci M等人以S-D大鼠作烧伤模型，研究比较切除伤部和以Ce（NO 3 ） 3 浴治疗对局部产生细胞因子的影响，发现Ce（NO 3 ） 3 对TNF-α有明显的抑制作用 ［5］ 。Claude R等也报道，经钆（GD）预先处理过的大鼠可抵御致死量LPS的攻击。将钆注射2天的大白鼠处死，分离其定居于肝脏窦状小管的具有吞噬功能的KC细胞，经内毒素刺激后，检测PGE 2 和TNF-α，发现钆可降低致炎物质PGE 2 的释放 ［6］ 。还有学者用ELISA测试发现含有LPS与氯化镧组的小鼠巨噬细胞培养基上清液中TNF-α含量明显低于LPS组，RT-PCR反应也证明氯化镧可使细胞TNF-α基因表达明显减少，说明氯化镧具有抑制LPS诱导巨噬细胞产生TNF-α的作用 ［7］ 。以上实验都说明稀土具有降低LPS毒性、抑制炎症介质释放的功能。
本实验发现，对LPS介导的HGF分泌TNF-α，LaCl 3 在1×10 -4 ～1×10 -6 mol/L浓度范围内均有显著的抑制作用且其作用与2μg/ml地塞米松效果相仿。众所周知，地塞米松对各种原因引起的非特异性炎症都有一定的抑制作用。另外，在1×10 -4 ～1×10 -6 mol/L浓度范围内，LaCl 3 对TNF-α分泌的影响与浓度无明显相关性。
本实验说明，LaCl 3 可抑制LPS介导的HGF分泌TNF-α，这与以往的相关实验报道一致。本实验结果提示LaCl 3 的抗炎作用可能是通过抑制LPS介导的炎症因子释放得以实现的。
参考文献
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作者单位:200072上海同济大学附属口腔医院（ ˇ 通讯作者）
同济大学医学院
复旦大学附属中山医院口腔科