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【摘要】 目的 研究生理、病理状态下安宫牛黄散中的朱砂、雄黄对机体作用的不同特点，探讨复方中朱砂、雄黄的药理作用机制。方法 将SD大鼠随机分成6组（8～10只/组）:正常组，正常+安宫牛黄散（下简称整方）组（278mg/kg）;正常+除去朱砂、雄黄的安宫牛黄散（下简称拆方）组（222.7mg/kg）;脑水肿模型组（一侧大鼠颈总动脉注射百日咳杆菌250亿/kg）;模型+整方组（造模前1h给药278mg/kg）;模型+拆方组（造模前1h给药222.7mg/kg）。一次给药后5h（模型组注菌后4h）采血、制备脑匀浆。用比色法测定脑组织、血清中碱性磷酸酶（ALP）、乳酸脱氢酶（LDH）总活力，琼脂糖凝胶电泳法测定血清中乳酸脱氢酶同工酶LDH 1～5 百分酶活力。结果 与正常组比较，模型组LDH总活力、LDH 1 、LDH 2 百分酶活力显著升高（P<0.01）;正常+整方组、正常+拆方组LDH总活力升高（P<0.05），LDH 1～2 百分酶活力均显著升高（P<0.01），LDH 4～5 百分酶活力下降（P<0.01），但除LDH 5 外，整方组和拆方组各项酶活力组间无显著差异。与模型组比较，模型+整方组、模型+拆方组LDH总活力显著下降（P<0.01），LDH 5 百分酶活力显著升高（P<0.01），但两组间无显著差异;模型+整方组LDH 2～3 百分酶活力显著下降（P<0.01），LDH 1，4 百分酶活力无显著变化;模型+拆方组LDH 1，4 百分酶活力显著下降（P<0.05，0.01），而LDH 2～3 百分酶活力变化不显著。结论 在正常生理状态下服用安宫牛黄散，对心肌、肾等有一定的损伤作用。在病理状态下（感染性脑水肿）安宫牛黄散和除去朱砂、雄黄的安宫牛黄散均可抑制被过度激活的LDH酶，两者之间无显著差异;但复方中的朱砂、雄黄对LDH同工酶水平有影响，提示它们可能通过作用于体内某些同工酶产生药理效应。
Effects of cinnabar and realgar in the complex on activities of lactate dehydrogenase and amounts of its isoenzymes in infectious cerebral edema rats
Tang Yishan，Ou Weiping，Wang Ningsheng
Institute of Clinical Pharmacology，Guangzhou University of TCM，Guangzhou510405.
【Abstract】 Objective To investigate the different effects of Cinnabar and Reaglar in Angong Niuhuang San on normal and pathological body.Methods A infectious cerebral edema model was induced by left internal carotid artery injection of pertussis bacilli（PB）in Sprague-Dawley rats.The rats were randomly allocated to six groups as followed:The control group and the model group were treated with0.9%NaCl（ig）;the control+drug（I）group and the control+drug（II）group were treated with Angong Niuhuang San and Angong Niuhuang San without Cinnabar and Reaglar with single dose of278mg/kg（ig）and222.7mg/kg（ig）respectively;and the model+drug（I）and the model+drug（II）group were treated with Angong Niuhuang San and Angong Niuhuang San without cinnabar and reaglar with single dose of278mg/kg（ig）and222.7mg/kg（ig）respectively one hour before injection of PB.Serum and brain samples were collected five hours after administration of the drugs.Activities of lactate dehydrogenase（LDH）in serum and brain were estimated by the method of colorimetry，and amounts of isoenzymes of serum lactate dehydrogenase（LDH1～5）were determinated by the method of gel electrophoresis.Results The activities of serum and brain LDH，LDH1and LDH2in the model group increase obviously compared with the control group（P<0.01）.The activities of LDH，LDH1and LDH2in the control+drug（I）group and the control+drug（II）group increase obviously（P<0.05，P<0.01），and LDH4and LDH5decrease obviously（P<0.01）compared with the control group.But except for LDH5，the amounts of LDH1～4and the activities of LDH in serum and brain have no significant difference between the control+drug（I）group and the control+drug（II）group.The activities of serum and brain LDH in the model+drug（I）and the model+drug（II）group increase obviously（P<0.01），and LDH5in both of these groups decrease obviously（P<0.01）compared with the model group（P<0.01）.However，there were also no significant difference between the activities of LDH and amount of LDH5in the model+drug（I）and the model+drug（II）group.The amounts of LDH2～3in control+drug（I）group decreased obviously（P<0.01），while the amounts of LDH1，4the control+drug（II）group decreased obvionsly（P<0.05，0.01）compared with the model group.The amounts of LDH1～4have significant difference between in the control+drug（I）group and the model+drug（II）group.Concluˉsion Injury to some organs，such as cardiac muscle and kidneywould be induced by Angong Niuhuang San in normal state.In pathological state of infectious cerebral edema，both Angong Niuhuang San and Angong Niuhuang San withˉout Cinnabar and Reaglar can refrain the over-agitated activities of LDH in serum and brain，but there are no signifiˉcant difference between these two drugs.However，Cinnabar and Realgar in Angong Niuhuang San are proven to have influence on the amounts of isoenzymes of serum LDH，which indicates that Cinnabar and Realgar may have some poˉtential pharmacological effects.
Key words Cinnabar Reaglar Angong Niuhuang San lactate dehydrogenase（LDH） isoenzymes of serum lactate dehydrogenase infectious cerebral edema
要提高含重金属和砷化物矿物药（如朱砂、雄黄）中药制剂的用药安全和排除该类药物的出口障碍，有必要对该类中药制剂进行深入研究和评价。重金属和砷化物对机体的作用强度除与其含量有关，还必须考虑剂量、存在状态、活性、与其它物质的拮抗或协同作用、个体生理病理状态;作用时间则与临床用药方案有关。以往对中药重金属和砷化物的研究主要集中在对中药材和中成药制剂中的重金属、砷化物的含量测定，或炮制工艺对Hg、As含量的影响，或Hg、As在动物体内的动力学研究，而对中药复方中及体内所含Hg、As的存在形态，不同生理、病理状态下的体内行为规律及深入到细胞或分子水平上的体内作用机理研究较少。安宫牛黄丸源自清代吴鞠通《温病条辨》，由牛黄、水牛角浓缩粉、麝香、珍珠、朱砂、雄黄、黄连、黄芩、栀子、郁金、冰片等11味药组成 ［1］ 。具有清热解毒，豁痰开窍的功效，主治热病，邪入心包，高热惊厥，神昏谵语。安宫牛黄丸（散）是中医凉开方剂的代表，现用于治疗多种脑病引起的昏迷和高热、脑血管意外、乙型脑炎、流行性脊髓膜炎、细菌性脑膜炎等多种脑损伤危急重症的救治 ［2］ 。本研究以安宫牛黄散为含朱砂、雄黄的中药复方的代表，考察生理、病理状态下安宫牛黄散中朱砂、雄黄对机体作用的不同特点，从而探讨复方中朱砂、雄黄的药效作用机理。
1 材料与方法
1.1 动物与分组 SD大鼠，雄性，体重250～300g，由第一军医大学实验动物中心场提供（合格证号:粤检证字第2001A060）。大鼠随机分成6组:正常组，正常+安宫牛黄散（下简称整方）组;正常+除去朱砂、雄黄的安宫牛黄散（下简称拆方）组;脑水肿模型组;模型+整方组;模型+拆方组。每组8～10只。
1.2 药品与试剂 （1）2%戊巴比妥钠。（2）百日咳诊断抗原（300亿/ml，购自中国药品生物制品检定所血清室，批号02-1）。（3）0.3%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液。（4）比色法测定血清和脑组织中的乳酸脱氢酶活力所需试剂 ［1］ ，包括:乳酸锂底物缓冲液（0.3mol/L，pH8.8）;11.3mol/L NAD溶液;1mmol/L2，4-二硝基苯肼溶液;0.4mol/L NaOH;0.5mmol/L丙酮酸标准液。（5）琼脂糖凝胶电泳法测定血清乳酸脱氢酶（LDH）同工酶所需试剂 ［2］ ，包括:巴比妥电泳缓冲液（pH8.6，0.05mol/L）;0.5%琼脂糖电泳凝胶;0.5M乳酸锂水溶液（pH7.0）;10mg/ml氧化型辅酶Ⅰ（NAD）水溶液;4mg/ml氯化硝基四氮唑蓝溶液（避光）;1mg/ml吩嗪二甲脂硫酸盐（避光）;甲醇;冰醋酸。（6）磷酸缓冲液（0.05mol/L，pH7.4）。
1.3 主要仪器 电泳仪;恒温箱;UPV GDS7600凝胶成像系统;岛津UV-260可见/紫外分光光度计。
1.4 大鼠脑感染性脑水肿造模方法 ［3］ 以戊巴比妥钠4mg/100g（体重）腹腔注射麻醉，取仰卧位，常规皮肤消毒，颈正中切口，分离出右侧颈总动脉，结扎近心端，在颈总动脉剪一“V”型切口，插管注射百日咳菌液（250亿/kg），15秒内注射完毕。结扎远心端。缝合肌肉和外皮。
1.5 给药方法 正常+整方组、模型+整方组一次胃饲安宫牛黄散（广东佛山制药一厂提供，以适量0.3%CMC-Na混匀）278mg/kg，正常+拆方组、模型+拆方组一次胃饲除去朱砂、雄黄的安宫牛黄散222.7mg/kg，其中模型+整方组、模型+拆方组在注射百日咳菌液前1hr灌药。正常组和模型组以等量生理盐水灌胃。
1.6 指标检测
1.6.1 样本的制备
1.6.1.1 血清样本的制备 用毛细管刺眼眶取血法，于实验前一天和药后5hr（模型组注菌后4hr）各取大鼠全血约1.5ml，室温下放置20min，然后以2500r/min离心10min，小心吸取上清液即为血清标本（溶血标本不用）。常温下保存备用。
1.6.1.2 脑匀浆样本的制备 大鼠取血后，断头处死。取出大脑，准确称取0.5g的右侧大脑组织。在匀浆器中加入脑组织和磷酸缓冲液（w:v=1:5）进行匀浆，转移至离心管中，进行冷冻离心（2℃，15000r/min，10min）得脑匀浆上清液。测定酶活力前用磷酸缓冲液稀释1:25。
1.6.2 乳酸脱氢酶活力测定 采用比色法 ［4］ 。
1.6.3 乳酸脱氢酶同工酶（LDH 1～5 ）的检测 采用琼脂糖凝胶电泳法 ［5］ 。
1.7 统计学方法 组间比较采用t检验。
2 结果
2.1 血清乳酸脱氢酶总活力 不同组别大鼠血清中LDH总活力的测定结果见表1。各组药前血清中LDH活力均无显著差异（与正常组对比，P>0.05）。与正常组比较，正常+整方组、正常+拆方组药后5h的血清LDH活力显著升高（P<0.05），但这两组的血清LDH活力之间的差异不显著（P>0.05）;模型+整方组、模型+拆方组药后5h的血清LDH活力显著升高（P<0.01），但这两组的血清LDH活力之间的差异也不显著（P>0.05）。与正常组比较，模型组造模（注菌后4h）后血清LDH活力显著升高（P<0.01），升幅近一倍。与模型组比较，模型+整方组、模型+拆方组药后5h的血清LDH活力均显著下降（P<0.05），但这两组的血清LDH活力之间无显著差异（P>0.05）。
2.2 脑组织乳酸脱氢酶总活力 不同组别大鼠脑组织中LDH总活力的测定结果见表1。与正常组比较，除模型组造模（注菌后4h）后脑组织中LDH活力显著升高（P<0.01）外，其余各组差异均无显著性（P>0.05）。与模型组比较，模型+整方组、模型+拆方组药后5hr的血清LDH活力均显著下降（P<0.01，P<0.05），但这两组的脑组织中LDH活力之间差异无显著性（P>0.05）。
2.3 血清乳酸脱氢酶同工酶百分酶活力 不同组别大鼠药后（模型组为注菌后4h）血清乳酸脱氢酶同工酶百分酶活力测定结果见表2。结果显示，与正常组比较，模型组LDH 1 、LDH 2 百分酶活力显著升高（P<0.01）;正常+整方组、正常+拆方组LDH 1～2 百分酶活力均显著升高（P<0.01），LDH 4～5 百分酶活力下降（P<0.01）。除LDH 5 外（P<0.01），正常+整方组和正常+拆方组各项同工酶百分酶活力组间无显著差异。与模型组比较，模型+整方组、模型+拆方组LDH 5 百分酶活力显著升高（P<0.01），但两组间LDH 5 百分酶活力无显著差异;模型+整方组LDH 2～3 百分酶活力显著下降（P<0.01），LDH 1 ， 4 百分酶活力无显著变化;模型+拆方组LDH 1，4 百分酶活力显著下降（P<0.05，P <0.01），而LDH 2～3 百分酶活力变化不显著。
表1 不同组别大鼠脑组织中LDH总活力的测定结果（略）
注:Drug（I）is referred to Angong Niuhuang San，and Drug（II）is referred to Angong Niuhuang San without cinnabar and reaglar.与正常组对比， - P>0.05， + P<0.05， ˇ P<0.01;与模型组对比 △ P<0.05;与正常+整方组对比， ■ P>0.05;与模型+整方组对比， ▲ P>0.05
表2 不同组别大鼠血清乳酸脱氢酶同工酶百分酶活力（略）
注:与正常组对比， ˇ P<0.01;与正常+整方组对比， + P<0.01;与模型组对比， △ P<0.01， ▲ P<0.05
3 讨论
3.1 对脑组织和血清中LDH酶总活力的影响 LDH酶参与糖酵解过程，当脑组织缺血或缺氧时，由于代偿机制，神经细胞内通过无氧酵解提供能量的活动加剧，使脑组织内的IDH酶活性增加。实验结果显示，模型组大鼠脑组织中LDH总活力与正常组比较，显著增高。正常生理状态下，给予安宫牛黄散和除去朱砂、雄黄的安宫牛黄散，不影响脑内LDH酶活力。感染性脑水肿病理状态下，给予安宫牛黄散和除去朱砂、雄黄的安宫牛黄散，均可显著降低脑内LDH酶活力，使LDH酶活力水平基本恢复到正常水平。这一结果说明，不论是安宫牛黄散，还是除去朱砂、雄黄的安宫牛黄散，在正常生理状态和病理状态下，对脑神经组织的作用存在差异。在病理状态下，对脑神经组织具有一定的保护作用。但复方中是否含朱砂、雄黄对生理或病理状态下脑内LDH酶活力的影响没有差异。
临床资料证明，测定血清LDH总活力对心脏疾病、肝 脏疾病和恶性肿瘤的诊断有一定意义。实验结果显示，正常生理状态下，给予安宫牛黄散和除去朱砂、雄黄的安宫牛黄散，均使血清LDH酶活力显著升高（升幅32.4%～38.4%），说明复方对机体脏器（尤其是肝脏）有一定影响。病理状态（感染性脑水肿）下，血清LDH酶活力显著升高（升幅近一倍），使血清LDH酶活力显著降低（降幅23.4%～28.5%），但未能恢复到药前水平，显示具有一定的药效作用。复方中是否含朱砂、雄黄对生理或病理状态下血清中LDH酶活力的影响没有差异。
3.2 对血清中LDH同工酶百分酶活力的影响 LDH五种同工酶LDH 1～5 的分布具有明显的组织特异性，如人的心肌、肾和红细胞中以LDH 1 和LDH 2 最多，脾、胰、甲状腺、肾上腺和淋巴结等以LDH 3 最多，骨骼肌和肝中以LDH 4 和LDH 5 最多。由于不同脏器或组织的LDH同工酶谱型不同，当其发生病变后，释放到血清中的各种同工酶的比例也不一致，所以，血清LDH酶的同工酶谱型的改变能较敏感、精确地反映出患病的部位和损伤的程度。在心肌梗死、病毒性或风湿性心肌炎、克山病时，血清LDH 1 和LDH 2 显著升高，尤以LDH 1 最明显;肝细胞受损时，LDH总活力和LDH 5 明显升高;肾脏受损时，LDH 2、3、4 的活性增高 ［6］ 。对缺氧缺血性脑病血和脑脊液LDH同工酶分析和相关性研究显示，LDH 3 活性测定可作为缺氧缺血性脑损伤及程度评价的参考指标 ［7］ 。实验中通过测定不同组别的LDH同工酶，考察生理、病理状态下复方中朱砂、雄黄对不同脏器的影响。正常生理状态下，给予安宫牛黄散和除去朱砂、雄黄的安宫牛黄散，均使血清LDH 1～2 百分酶活力均显著升高，显示对心肌、肾脏、红细胞等有一定损伤。感染性脑水肿病理状态下，给予安宫牛黄散和除去朱砂、雄黄的安宫牛黄散对血清LDH同工酶的影响有较大差异:给予安宫牛黄散，使造模后显著升高的LDH 2～3 百分酶活力显著下降，基本恢复到药前水平，表明安宫牛黄散在病理状态下对机体（心肌、肾、脾、胰、甲状腺、肾上腺和淋巴结等）的损伤作用比在正常生理状态下小。安宫牛黄散对血清中LDH 1，4 百分酶活力无显著影响。给予除去朱砂、雄黄的安宫牛黄散，使造模后显著升高的LDH 1 百分酶活力显著下降，说明给予除去朱砂、雄黄的安宫牛黄散在病理状态下对机体（心肌、肾等）的损伤作用比在正常生理状态下小。除去朱砂、雄黄的安宫牛黄散使造模后显著下降的LDH 4 百分酶活力进一步下降，而对LDH 2～3 百分酶活力的影响不显著。
3.3 中药复方中朱砂、雄黄的作用 中药复方中所含的重金属（如汞、铅）和砷化物被认为是引起毒副作用的原因之一。含重金属和砷化物的矿物药作为药物加入处方中，的确与现代卫生、生活观念有着极大的冲突。无机汞或有机汞能与蛋白质和酶中的配体络合，表现在光谱特性的变化与活性的改变，形成有害的一类金属硫蛋白，造成氧化性损害，是汞致毒作用机制之一。朱砂主要成分为HgS，其溶解度为1.4×10 -24 g/L ［8］，可溶出的游离汞含量是极低的。有研究显示，一定剂量的汞不仅能抑制某些酶的活性，在一定条件下却能提高某些酶的活性，如乳酸脱氢酶、碱性磷酸酯酶、β-葡萄糖苷酸酶、N-乙酰氨基碳葡萄糖胺酶等 ［9］ 。砷化物可分为三价砷和五价砷，或无机砷和有机砷，它们在体内的相互转换和代谢决定着砷的毒性作用。三价砷的毒性比五价砷大，毒性强度比从10倍到几十倍 ［10］ ;无机砷的毒性比有机砷大。雄黄的化学式为As 2 S 2 ，砷的价态和结构较单纯的三价砷和五价砷更为复杂。另一方面，人们很早就发现砷对人也有许多有益作用，如微量砷可刺激生血，促进细胞的生长、繁殖。八十年代以后的有动物实验研究表明，极微量的砷对动物的某些发育是必需的。基于此，甚至有学者开始将砷列为必需的微量元素，并建议成人每日砷的需要量为6μ/1000kcal或12～25μg ［10］ 。另外，砷剂（三氧化二砷、雄黄）在临床上治疗白血病的有效性，使细胞凋亡很可能成为肿瘤治疗的新策略 ［11～12］ 。可见，一方面砷具有毒性，另一方面，在临床上的应用显示其具有一定的药用价值。由于砷的生物功能及其特殊作用尚未被充分证实，因此对砷的功能评价还有争论。
一般认为以离子形态存在的金属元素是可被生物利用的形态（bioavailable fraction），故有毒重金属的游离离子被认 为是主要毒性形态。这些离子与特定结构的生物配体（如氨基酸、核苷酸、蛋白质等）结合，以各种方式破坏或干扰有机体的正常生理活动，由此产生毒性。其毒性受非生理因素（pH、温度、硬度、游离离子浓度、电荷、大小以及无机、有机试剂的络合作用等）和生理因素（如个体大小、体重、生长期、耐受性、应激能力、病理状态等）决定 ［13］ 。所以评价中药复方中朱砂、雄黄的生理活性（药效或毒性），也不能单凭某一重金属（汞）或砷的含量，即判定是引起中药毒副作用的原因。因为此类矿物是作为药物进入机体，故尤其要考虑机体的生理、病理状态，并结合药物的功能主治考察其对病理状态的影响。
本课题组曾观察安宫牛黄丸对脑梗塞模型大鼠血清乳酸脱氢酶同工酶的影响 ［14］ ，实验表明安宫牛黄丸在局灶性脑梗塞病理状态下对机体的损伤作用比在正常生理状态下小，提示安宫牛黄丸在生理、病理状态下，对机体的作用方式和途径很可能存在差异。同时，根据文献报道的有关在某些情况下生物体对一定剂量的汞、砷具有积极性反应。由此，就复方中朱砂、雄黄的作用机理提出”病理状态下，一定用药剂量范围内，含矿物药中药制剂中的朱砂、雄黄可能通过调节某些病理状态下过度激活或抑制的酶活力（或同工酶活力），从而产生一定的药效作用”的假设。
本实验的研究结果表明，在正常生理状态下服用安宫牛黄散，对心肌、肾等有一定的损伤作用。在病理状态下（感染性脑水肿）安宫牛黄散和除去朱砂、雄黄的安宫牛黄散均可抑制被过度激活的脑组织和血清中的LDH酶，两者之间无显著差异;但复方中的朱砂、雄黄对LDH同工酶谱型有影响，对病理状态下出现的LDH同工酶谱出现的异常升降具有一定“复衡”作用:如给予安宫牛黄散，使造模后显著升高的LDH 2～3 百分酶活力显著下降，基本恢复到药前水平;而除去朱砂、雄黄的安宫牛黄散使造模后显著下降的LDH 4 百分酶活力进一步下降，提示它们可能通过作用于体内某些同工酶产生药理效应。这为上述假设提供了一定的实验依据。
近两年来有文献报道对含有朱砂、雄黄等矿物药的复方进行了拆方研究，探讨除去朱砂或雄黄后对复方药效作用的影响:杨士友等 ［15～17］ 研究了去雄黄牛黄解毒片对抗炎镇痛、抗流感病毒、抗菌及解热等作用的影响，结果显示其作用与原方基本一致。赵雍等 ［18］ 对安宫牛黄丸与不含朱砂、雄黄的安宫牛黄丸对大脑中动脉栓塞模型大鼠梗塞面积、脑含水量及过氧化氢酶（CAT）、脂质过氧化物（LPO）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、乳酸（LD）含量的影响的比较研究表明:二者对大鼠脑组织损伤均有一定的改善和保护作用，但两者之间未见显著性差异，提示安宫牛黄丸中的朱砂、雄黄对大鼠脑缺血梗塞的保护作用未有明显影响。这些实验工作为含朱砂、雄黄中药复方的配方改革提供了实验依据。笔者认为，鉴于含有朱砂、雄黄的中药复方占药典成方总数的10%以上，所涉及的复方及其功能主治、临床适应症数量、种类繁多。尤其像安宫牛黄丸和牛黄解毒片等古方，沿用至今，有着公认的疗效，其中的雄黄、朱砂在配伍中是否必不可少，去除后是否影响其疗效，对朱砂、雄黄的药效作用机制和安全性评价尚需进行大量深入、全面的研究。其中寻找和选择对朱砂、雄黄对机体（尤其是病理状态下）作用的特异、敏感的评价指标是研究的关键和难点之一。
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ˇ 基金项目:广东省自然科学基金资助项目（No.174）
作者单位:510405广州中医药大学临床药理研究所