中药藤黄抗肿瘤作用机制初探

　　【摘要】 目的  初步研究中药藤黄抗肿瘤作用的机制。 方法  从细胞增殖周期特异性、和细胞凋亡二方面就藤黄酸对人肝癌细胞系Bel-7402的抑制作用进行研究，并观察藤黄酸对细胞微管蛋白的影响。 结果  藤黄酸对Bel-7402细胞的抑制作用表现为细胞增殖周期特异性，无明显诱导细胞凋亡的作用。 结论  藤黄酸可抑制微管蛋白聚合，影响微管形成。
     
    
　　Primary study of anti-tumor mechanism of gambogic acid
     
　　Zhang Jin，Li Baohua，Xu Guozeng，et al.
   
　　Preclinical Pharmacologic Center，Cancer Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing100021.
   
　　【Abstract】 Objective To study the anti-tumor mechanism of gambogic acid.Methods The effect of gam-bogic acid on liver cancer lines Bel-7402was studied by proliferation cycle and apoptosis and on canaliculus protein was observed.Results The inhibiting effect of gambogic acid on Bel-7402cell cycle particularity，but couldn't in-duce the cell apoptosis.Conclusion The gambogic acid could inhibit polymerization of canaliculus protein.
   
　　Key words gambogic acid anti-tumor mechanism
      
　　藤黄（Gamboge）是一种传统的中药制剂，系藤黄科植物藤黄所分泌的干燥树脂，主产于东南亚一带，我国南方也有分布。据祖国医学记载，本品酸涩有毒，具有消肿、化瘀、止血、杀虫等功用，临床上用于治疗痈疽肿毒、顽癣恶疮 ［1］ 并有抗肿瘤作用的早期报道 ［2，3］ ，而有效成分总藤黄酸具有抗肿瘤、抗转移和诱导肿瘤细胞分化等作用也已得到证实 ［4，5］ ，但其作用机制少有研究。因此我们从细胞增值周期特异性的细胞凋亡两方面就藤黄酸对肿瘤细胞的抑制作用进行了探讨，并初步观察了它对细胞微管蛋白功能的影响。

　　1 材料与方法
    
　　1.1 瘤株 人肝癌细胞系Bel7402，中国医学科学院肿瘤研究所提供。
   
　　1.2 注射用总藤黄酸 亮黄色结晶，C 33 H 44 O 8 ，分子量628.75，南京海光应用化学研究所提供。

　　1.3 方法
   
　　1.3.1 药物作用细胞周期特异性的研究 将处于生长对数期的Bel7402细胞用含有10%小牛血清的RPMI1640培养液稀释为1×10 5 /ml细胞悬液分装于培养瓶中，37℃，5%CO 2 培养24h，摇床轻摇0.5h，取上清，离心后收集细胞，为M期细胞，将培养瓶中贴壁细胞胰酶常规消化处理后收集为M期外细胞，以MTT法 ［6］ 分别就藤黄酸对二类细胞的抑制作用进行测定，药物浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0μg/ml，按公式（1-试验组OD值/对照组OD值）×100%计算细胞生长抑制率，并就其随药物浓度变化作图。
   
　　1.3.2 药物诱导肿瘤细胞凋亡研究 （1）形态学观察:将处于生长对数期的Bel7402细胞用含有10%小牛血清的RPMI1640培养液稀释为1×10 5 /ml细胞悬液分装于2cm培养皿中，5ml/皿，37℃，5%CO 2 培养24h后加入以RP-MI1640培养液溶解的注射用藤黄酸使其终浓度分别为0.2、0.4、0.8、1.6μg/ml，同时设空白对照，继续培养24h后弃去培养液加入PI染色液0.5ml（20mg/ml）及Hoechst33342（2mM）50μl室温放置30min，弃去染色液PBS漂洗3次后激光扫描共聚焦显微镜（Meridian Inc Insight Plus488nm5mW）观察，随机计数100个细胞中坏死、凋亡及正常细胞并选取典型视野拍照。（2）DNA Ladder将处于生长对数期的Bel7402细胞用含有10%小牛血清的RPMI1640培养液稀释为1×10 5 /ml细胞悬液分装于培养瓶中，37℃，5%CO 2 培养24h，加入以RPMI1640培养液溶解的注射用藤黄酸终浓度分别为0.1、0.2、0.4μg/ml，同时设空白对照，继续培养24h后常规方法提取细胞总DNA进行琼脂糖凝胶电泳，紫外光（302nm）下观察结果。
   
　　1.3.3 药物抗微管作用研究 健康成年大鼠，雌雄兼用，取脑组织剥去脑膜和大血管，生理盐水冲洗后剪碎，4℃条件下1∶1（w/w）加入冷MES缓冲液（0.1M，pH6.5，用前加入终浓度为1mM的ATP）以玻璃研磨器制成匀浆，4℃100，000g离心1h，取上清加入等体积聚合缓冲液（含5M甘油的MES缓冲液）置37℃30min后常温下100，000g离心1h，取沉淀得到微管蛋白，测定蛋白含量，以MES缓冲液稀释至5mg/ml为测定液置冰浴备用。注射用藤黄酸以MES缓冲液溶解后加入微管蛋白测定液，终浓度分别为1μM，5μM和10μM，同时设阴性对照组，以MES缓冲液校正0点，波长365nm。样品加入比色杯（提前37℃恒温）置37℃保温，于第1、3、5、10、15、20min时测定OD值，并就其随时间变化作图。
    
　　2 结果
    
　　2.1 藤黄酸对人肝癌Bel7402M期和M期外细胞抑制作用的量效关系 见图1。
   
　　2.2 藤黄酸对人肝癌Bel7402细胞诱导凋亡实验 结果中，荧光染色后坏死细胞、凋亡细胞和正常细胞百分比见表1。DNA Ladder凝胶电泳未显示特征性梯带且随药物浓度增大产生明显脱尾。
 
　　图1 藤黄酸对人肝癌细胞系Bel-7402的抑制作用（略）

　　表1 藤黄酸对肝癌细胞系Bel-7402诱导凋亡 （略）
   
　　2.3 不同浓度藤黄酸对微管蛋白聚合作用的影响 见图2。
 
　　图2 不同浓度藤黄酸对微管蛋白聚合的影响（略）
   
　　3 讨论
    
　　藤黄具有抗肿瘤作用的发现始于上世纪80年代 ［2］ ，并有人进一步确定了其有效成分为藤黄酸 ［3］ 。局限于当时的技术水平，研究的范围和深度受到了一定的影响，近10年来少有深入的报道。制剂工艺的发展为藤黄酸的深入研究提供了保障，我们使用高纯度（>98%）及良好溶解性的注射用总藤黄酸在抗肿瘤、抗转移和对肿瘤细胞诱导分化等方面开展了一系列的工作 ［4，5］ ，并且进一步对其作用机制进行了初步探索。
   
　　根据细胞动力学原则，组织中的细胞可分为增殖期、静止期和无增殖力的细胞三部分，而抗肿瘤药物作用的目标主要是处于增殖期内的肿瘤细胞并按其对增殖周期各期细胞有无选择性分为周期特异性和非周期特异性二类，而周期特异性药物又可分为作用于M期或M期外（主要是S期）二个亚类。我们利用贴壁细胞增殖周期不同时相粘附能力不同的特点，采用物理振摇方法将人肝癌细胞粗分为M期和M期外二部分，以同样剂量藤黄酸分别对其进行生长抑制试验，结果显示M期细胞对藤黄酸的生长抑制作用敏感性明显高于M期外细胞，因此可判断藤黄酸抗肿瘤作用具有针对M期的细胞周期特异性。
   
　　通过引发细胞凋亡而对肿瘤进行治疗是目前寻找抗肿瘤新药的思路之一，细胞凋亡与细胞坏死的根本区别在于细胞死亡过程中超显微结构变化不同并伴有新的蛋白质合成。细胞膜通透性、形态学的DNA结构变化是检测细胞凋亡的三类主要指标，其中细胞膜完整性是细胞凋亡的前提，形态学指标是确定细胞凋亡的主要依据 ［7］ 。我们采用Hoechst33342（DNA活体染料）和PI（坏死细胞DNA染料）对经不同浓度藤黄酸处理的Bel-7402细胞进行联合染色，即可从形态上区分凋亡、坏死及正常细胞，其中被PI着色的为坏死细胞，不被PI着色而被Hoechst33342着色其中染色质凝集的是凋亡细胞而染色质均匀分布的是正常细胞。细胞凋亡过程中核酸内切酶被激活使染色体DNA降解、断裂从而在DNA琼脂糖凝胶电泳上显示为200左右碱基为基数大小的条带即DNA Ladder，是细胞凋亡的另一个证据。试验结果显示，坏死细胞百分比与藤黄酸浓度呈正相关，而凋亡细胞百分比随药物浓度提高先递增而后递减，但在最适浓度其绝对值较低，表明藤黄酸对Bel-7402细胞诱导凋亡的作用不大，而DNA Ladder未显示特征性梯带且随药物浓度增大产生明显脱尾的现象也支持这一结论。
   
　　微管是构成真核细胞骨架的主要成分由微管蛋白及相关蛋白组成，也是作用于M期抗肿瘤药物的重要靶点，抗微管药物通过影响微管蛋白的聚合进而干扰细胞的分裂过程达到抗肿瘤的目的。本试验中微管蛋白的聚合表现为光密度值的增大，从试验结果可以看出，藤黄酸对微管蛋白聚合的抑制作用明显大于对照组且强度与剂量呈正相关，因此可以初步认为抑制微管蛋白聚合继而影响微管的形成是藤黄酸抑制M期细胞增殖的手段之一。该试验方法简便仅限于初步观察，可采用猪或牛脑为原料制备较大量的微管蛋白，并将高、低温差下的沉淀、离心纯化循环进行2～3次，提高微管蛋白的纯度，进行更深入的研究。
    
　　参考文献
    
　　1 江苏医学院.中药大词典.上海:上海人民出版社，1977，2695.

　　2 曹济民.藤黄提取液对人体肝癌细胞瘤株抑制作用的实验观察.江西医药，1980，（3）:1-2.
   
　　3 雷秋模，刘金妹，龚德恩.藤黄抗癌的实验研究.中华肿瘤杂志，1985，（4）:282.
   
　　4 张谨，王永泉，张立生，等.中药藤黄抗肿瘤作用的研究.中华临床实用医药杂志，2002，（9）:1-3.
   
　　5 张谨，张询，王永泉，等.藤黄酸对肿瘤细胞诱导分化作用的探讨.实用癌症杂志，2003，（1）:9-10.
   
　　6 鄂征.组织培养和分子细胞学技术.北京:北京出版社，1999，202.
   
　　7 Tannock IF，Lee CE.Evidence against apoptosis as a major mechanism for reproductive cell death following treatment of cell lines with anti-cancer drugs.The Brit J of Cancer，2001，84（1）:100-105.
    
　　作者单位:100021北京中国医学科学院肿瘤医院药理中心