EGb761对β-淀粉样蛋白损伤的保护作用

　　【摘要】 目的  观察银杏叶提取物EGb761体外抗β-淀粉样蛋白（Aβ）损伤的作用。 方法  用MTT法检测细胞的增殖活性;释放到细胞外的LDH活性检测细胞膜的损伤;Caspase-3活性检测细胞凋亡。 结果  EGb761呈剂量依赖性提高Aβ损伤引起的SY5Y细胞的存活率降低，降低Aβ损伤引起的LDH释放及Caspase-3活性增加。 结论  EGb761对Aβ 25-35 损伤有保护作用。
     
   
　　Effects of EGb761on SH-SY5Y cells against damage induced by Aβ
    
　　Wang Yuehua，Du Guanhua
    
　　Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College，Beijing100050.
   
　　【Abstract】 Objective To investigate the protective effects of EGb761on SH-SY5Y cells against damage induced by amyloidβ-peptide（Aβ）.Methods The viability of SH-SY5Y cells was measured byMTT assay.The loss of membrane integrity and cell lysis was measured by assay the release of lactic dehydrogenase（LDH）.The activ-ity of caspase-3in cells was measured by means of the cleavage of fluorogenic substrate Ac-DEVD-MCA.Results EGb761could respectively improve the survival of SH-SY5Y cells.The results also showed that EGb761signifi-cantly decreased Aβ-induced LDH release and reduced the Aβ 25-35 -induced increase of caspase-3activity.Con-clusion EGb761protected SH-SY5Y cells against toxicity induced by Aβ.
   
　　Key words amyloidβ-protein（Aβ） EGb761 SH-SY5Y cell
      
　　银杏叶提取物是从银杏叶中提取的有效成分，目前用于临床的银杏叶提取物［商品名EGb761］，它含有24%的黄酮甙和6%的银杏内酯，很久以来在中国广泛用于多种疾病的预防治疗。早在20世纪60年代就用其提取物6911应用于冠心病心绞痛的治疗;而德国于1972年即有报道用于治疗心、脑及外周血液循环障碍性疾病;自1975年在法国开始用于临床，至今已在30多个国家中广为应用 ［1］ 。作为自由基清除剂，可抗脂质过氧化及升高抗氧化酶的活性，如谷胱甘肽过氧化物酶等 ［2］ 。因此，EGb761具有广泛的生物效应，尤其对中枢神经系统的损伤具有保护作用，如可改善老年小鼠的学习记忆功能障碍 ［3］ 。
   
　　β-淀粉样蛋白（Aβ）是阿尔茨海默病（AD）脑中神经炎斑块的主要成分，Aβ在脑内沉积的范围与神经损伤、认知障碍及记忆缺失的程度相关 ［4］ 。一些证据表明Aβ的神经毒性与氧化应激有关，活性氧自由基的产生会损伤神经元的膜脂质、蛋白及核酸 ［5］ 。因此有人提出用抗氧化剂治疗AD中Aβ介导的神经毒性。本实验观察了EGb761对Aβ 25-35 损伤的保护作用，对其作用机制进行了探讨。

　　1 材料与方法
    
　　1.1 试剂 1640培养基购自GIBCO公司，加入56℃灭活的10%胎牛血清;SH-SY5Y细胞;银杏叶提取物EGb761;Aβ 25-35 （溶于双蒸水中，微孔滤膜过滤除菌，置37℃老化7天）、胰蛋白酶、噻唑蓝（MTT）购自Sigma公司;LDH试剂盒购于北京化学试剂公司;Caspase-3底物Ac-DEVD-AMC为PHARMINGEN公司产品。
   
　　1.2 EGb761对Aβ 25-35 损伤的保护作用 SY5Y细胞3×10 5 /ml接种于96孔板中，铺满后吸除原培养基，换上无血清的1640培养基，加入终浓度为1、10、100μg/ml的EGb761，1h后加入终浓度为50μM的Aβ 25-35 ，继续培养48h，测定细胞存活率;培养液上清液中LDH含量;细胞中Caspase-3活性。
   
　　1.3 MTT检测 损伤48h后，弃去培养液，每孔加入MTT液100μl，使终浓度0.5mg/ml，于37℃5%CO 2 继续培养4h，去上清，每孔加入100μl，振荡后于540nm处测定OD值 ［6］ 。

　　1.4 培养液中LDH含量的测定 吸出上述细胞培养液，每孔混匀后，取50μl与250μl乳酸盐缓冲基质混合，37℃水浴15min;然后加入5mg/ml辅酶I50μl，37℃水浴15min;加入0.2mg/ml2，4-二硝基苯肼250μl，于37℃水浴15min;再加入0.4mol/L NaOH2.5ml，于440nm处测定OD值（参照LDH试剂盒）。以空白培养基平行做空白对照，Lowry法定蛋白含量。
   
　　1.5 细胞中Caspase-3活性的测定 处理结束后，200×g室温离心5min，收集细胞，并用PBS洗一次，离心。沉淀中加入1ml细胞裂解液（Tris10mmol/L，NaH 2 PO 4 /Na 2 HPO 4 10mmol/L，NaCl130mmol/L，NaPPi10mmol/L，1%Triton X-100，pH7.5），冰浴30min。荧光测定专用96孔板中，每孔加入上述细胞裂解液20μl，caspase-3底物20μmol/L，以蛋白酶测定液（HEPES20mmol/L，DTT2mmol/L，10%glycerin，pH7.5）补足至终体积200μl。设试剂空白和正常细胞空白对照。混匀后，于激发波长380nm，发射波长430nm立即测定荧光值作为初始荧光值，37℃温育1h后再次测定荧光一次 ［7］ 。Lowry法定蛋白。
    
　　2 结果
    
　　实验结果表明，与Aβ 25-35 损伤组相比，10、100μg/ml EGb761分别使SH-SY5Y细胞存活率升高16.7%（P<0.05）和22.3%（P<0.01）（见Table1）;10、100μg/ml EGb761分别使Aβ 25-35 损伤引起的LDH释放降低25.8%（P<0.05）和35.2%（P<0.01）（见Table2）;低剂量和中剂量EGb761对Aβ 25-35 损伤引起的Caspase-3活性增高没有显著作用，100μg/ml EGb761组与Aβ 25-35 损伤组相比，Caspase-3活性增高12.1%（P<0.05）（见Table2）。
   
　　Table1 Effects of EGb761on viability decrease induced by Aβ 25-35 in SH-SY5Y cells.（略）
   
　　Data were expressed as the mean±SD，n=6. * P<0.05， ** P<0.01vs control; # P<0.05， ## P<0.01vs Aβ 25-35 group

　　Table2 Effects of EGb761on LDH release and the activity of Caspase-3in SH-SY5Y cells.（略）
   
　　Data were expressed as the mean±SD，n=6. * P<0.05， ** P<0.01vs control; # P<0.05， ## P<0.01vs Aβ 25-35 group.

　　3 讨论
    
　　本实验利用Aβ 25-35 损伤模型，用以寻找对Aβ 25-35 损伤有保护作用的药物。在本实验中，将毒性片段Aβ 25-35 于37℃温育7天，“老化”为具有神经毒性的聚集状态。老化的50μM Aβ 25-35 与SY5Y细胞共同孵育48h，可显著降低细胞存活率，增加细胞内LDH释放到细胞外，并使细胞内Caspase-3活性增高。因此我们可以推测Aβ通过破坏细胞膜，促进细胞调亡等机制引发细胞损伤，这些作用可能在AD的发病过程中起重要作用。
   
　　至今，关于Aβ诱导细胞死亡的途径还不清楚，Aβ引发AD有多种解释。然而，有一种假说认为Aβ的神经毒性是由自由基诱导产生的，推测由Aβ直接启动或由细胞间活性氧的增多间接启动 ［8］ 。Hardy ［9］ 等人提出“淀粉样变级联学说”，认为Aβ在脑内的沉积是引发AD的主要原因，Aβ能激活小胶质细胞释放炎症细胞因子，同时也直接诱发小胶质细胞产生呼吸暴发，生成大量的自由基，从而损害神经元。退变的神经元释放有毒物质，这些有毒物质又刺激其它胶质细胞释放神经毒因子和炎性因子，这样形成恶性循环，最终导致神经细胞的死亡。
   
　　实验结果表明，EGb761对Aβ 25-35 损伤引起的细胞存活率降低以及细胞膜破裂LDH释放增加有一定的保护作用;高浓度EGb761对Aβ 25-35损伤引起的细胞凋亡也有一定的保护作用。因此，我们推测EGb761对Aβ损伤有保护作用，对AD病的预防治疗可能会有一定的作用。通过进一步实验验证，其作用机理可能与它的抗氧化作用有关。EGb761对过氧化氢损伤有较好的保护作用，说明银杏叶提取物能有效清除体内自由基，提高机体抗氧化能力。银杏叶提取物主要含有黄酮甙、银杏苦内酯等有效成分。药理实验研究认为，银杏黄酮甙具有提高体内SOD活性和清除自由基的作用 ［10］ ，其作用机理可能为黄酮甙类化合物分子含有还原性羟基功能基团，可直接捕捉和清除自由基，发挥其抗氧化作用。
     
　　参考文献
    
　　1 孙久荣，刘文胜.银杏叶提取物对中枢神经系统的作用.中国药理学通报，1998，14（4）:300-303.
   
　　2 Bilgihan A，Aricioglu A，Bligihan K，et al.The effect of EGb761on retinal lipid peroxidation and glutathione peroxidase level in experimen-tal lens induced uveitis.Int Opthalmol，1994，18（1）:21-24.
   
　　3 Stoll S，Scheuer K，Poh IO，et al.Ginkgo biolba extract（EGb761）independently improves changes in passive avoidance learing and brain membrane fluidity in the aging mouse.Pharmacopsychiatry，1996，29（4）:144-149.
   
　　4 Huang H，Ou H，Hsieh S.Antioxidants prevent amyloid peptide-in-duced apoptosis and alteration of calciumhomeostasis in cultured cortical neurons.Life Sci，2000，66:1879-1892.
   
　　5 Harris ME，Hensley K，Butterfield DA，et al.Direct evidence of ox-idative injury produced by the Alzheimer's beta-amyloid peptide（1-40）in cultured hippocampal neurons.Exp Neuron，1995，131:193-202.
   
　　6 Frances HC，Andrea B，Francisco JM，et al.PC12and Neuro2a cells have different susceptibilities to acetylcholinesterase-amyloid complex-es，amyloid 25-35 fragment，glutamate，and hydrogen peroxide.J Neu-rosci Res，1999，56:620-631.
   
　　7 Allen JW，Eldadah BA，Huang X，et al.Multiple caspases are in-volved inβ-amyloid-induced neuronal apoptosis.J Neurosci Res，2001，65:45-53.
   
　　8 Behl C，Davis JB，Lesley R，et al.Hydrogen peroxide mediates amyloid beta protein toxicity.Cell，1994，77:817-827.
   
　　9 Hardy JA，Higgins GA.Alzheimer's disease:the amyloid cascade hy-pothesis.Science，1992，256（5054）:184-185.
   
　　10 杨义芳，吴国友.银杏叶药理研究.现代应用药学，1995，12（5）:17. 

　　* 基金项目:国家自然科学基金项目（编号:30171148）
   
　　作者单位:100050北京中国协和医科大学药物研究所