缺氧诱导促红细胞生成素在卵巢癌细胞系中的表达

　　【摘要】 目的  探讨促红细胞生成素（Erythropoie，Epo）在卵巢癌细胞系中的表达及缺氧对其表达的影响，为进一步研究Epo在卵巢癌的发生发展中的作用打下基础。 方法  应用免疫细胞化学S-ABC法检测Epo蛋白、原位杂交法检测Epo mRNA在卵巢癌细胞系3AO中的表达及不同时间的缺氧处理后表达强度的改变。 结果  Epo及其mRNA在体外培养的卵巢癌细胞系中存在弱阳性表达，缺氧处理后表达明显增强，二者差异有非常显著性（P<0.001），Epo的表达主要定位于细胞浆、核膜。 结论  Epo在卵巢癌细胞系中存在基础表达且受缺氧影响，Epo可能在卵巢癌的恶性生长及抗凋亡等环节发挥作用。
           
　　The expression of hypoxic-induced erythropoietin in ovarian carcinoma cells line
     
　　Liu Xiaofeng，Chen Biliang，Ma Xiangdong，et al.
   
　　Department of Obstetrics and Gynecology，Xijing Hospital，Fourth Military Medical University，Xi'an710032.
   
　　【Abstract】 Objective To investigate the expression of erythropoietin（Epo）in normal and hypoxia in ovarian carcinoma cell line and to study the role of Epo in the tumorigenesis and development of ovarian carcinoma.Methods Immunocytochemical assay（S-ABC）was used to detect the expression of Epo in ovarian carcinoma cell line and to find the change of the intensity of the expressions by dealing with different hypoxic degree.Results The expression of Epo mainly locate in cytoplasm and karyotheca of ovarian carcinoma cells.The positive expression of Epo in normal was significantly lower than that in hypoxia（P<0.001）.Conclusion The expression of Epo in ovarian carcinoma can be affected by hypoxia and Epo may play important roles in the anti-apoptosis and malignant development of o-varian carcinoma.
   
　　Key words erythropoietin Epo hypoxia anti-apoptosis ovarian carcinoma cell line
      
　　促红细胞生成素（erythropoietin，Epo）是一种糖蛋白，传统观点认为，Epo由肾脏分泌，主要作用于骨髓造血细胞，促进红系祖细胞增殖、分化，作用及分布都较为单一，近来相继有学者发现在许多正常组织及恶性肿瘤中也存在Epo表达。除促红细胞生成外，它的非造血作用相继被发现、阐明;Epo对于恶性肿瘤的生物学作用也成为研究热点。目前Epo与卵巢癌的相关性研究还少见报道，我们希望从Epo与缺氧的角度对卵巢癌的病理生理机制做一探讨。

　　1 材料与方法
    
　　1.1 材料 卵巢癌细胞株3AO取自第四军医大学西京医院妇产科实验室，体外传代培养;Epo鼠抗人单克隆抗体（实验浓度1:100）系Santa Cruz公司产品，二抗为羊抗鼠IgG及新鲜小牛血清由北京中山生物技术有限公司生产;SABC免疫组化试剂盒、Epo原位杂交试剂盒由武汉博士德生物工程公司购买;缺氧培养箱为本院神经内科实验室提供（示意图如图1），缺氧环境为95%N 2 ，5%CO 2 。
   
　　图1 缺氧培养装置示意图（略）
　　
　　1.2 方法与分组 培养瓶中加入1640完全培养液（15%小牛血清，2mmol/L谷氨酸钠，1%青链霉素），培养细胞系至对数生长期使细胞密度达10 6 /ml，接种于六孔板内进行细胞爬片，24h后待细胞全部贴壁后分为两组，有氧组置于正常37℃有氧孵箱内，缺氧组置于37℃缺氧培养箱内，取2h、8h、24h三个时间段对两组细胞分别做免疫细胞化学鉴定观察:95%乙醇固定，3%双氧水室温孵育15min，去离子水冲洗后，再用正常羊血清封闭液室温孵育30min，吸去多余的血清封闭液，滴加一抗40μl，37℃孵育3h，PBS液冲洗3次，每次5min;滴加二抗，室温孵育30min，PBS液冲洗3次，每次5min;滴加SABC酶试剂，室温孵育30min，PBS液冲洗3次，每次5min;每张切片滴加2滴新鲜配制的DAB溶液显色，显微镜下观察，待显色清晰时用去离子水冲洗，苏木精复染，再用95%乙醇、无水乙醇、二甲苯脱水，中性树胶封固。每批染色均设立对照，以0.01M PBS液代替一抗为阴性空白对照。原位杂交实验所用溶液均加入1ml/L DEPC灭活RNA酶，8h后高压灭菌备用，整个实验过程严格在无核酶环境下进行，防止核酶污染造成假阴性结果，DAB显色，用不含探针的PBS溶液代替杂交液作为染色的阴性对照，用已知Epo mRNA染色阳性的胎儿肾脏组织切片作为阳性对照。
   
　　1.3 结果判断 高倍显微镜（10×40）下观察细胞着色情况，免疫组织化学半定量评分标准 ［1］ :即对每张切片的阳性细胞率及阳性细胞着色强度分别进行分级记分，然后根据两项之和确定其阳性表达强度。每张切片任意选5个视野，观察其细胞着色强度，无表达为阴性（0分）、阳性颗粒呈浅黄色为可疑阳性（1分）、浅棕色为弱阳性（2分）、棕黄色为阳性（3分）、棕褐色为强阳性（4分）。计算阳性细胞百分数（5个视野的平均数），无表达为阴性（0分）、1%～15%为可疑阳性（1分）、16%～50%为弱阳性（2分）、51%～85%为阳性（3分）、86%～100%为强阳性（4分）。按公式（阳性细胞表达强度×阳性细胞百分数） 1/2 计算出该标本的表达强度指数。原位杂交结果判定方法相同。
   
　　1.4 统计学方法 采用SPSS11.0统计学软件，结果用ˉx±s表示，采用t检验（因所选时间段过少未进行缺氧时间与Epo表达强度的直线相关分析）。P<0.05为有统计学意义。
    
　　2 结果

　　Epo的表达强度见表1，EpomRNA表达强度见表2。Epo及mRNA在有氧组弱阳性表达，胞浆可见淡黄色颗粒，缺氧组中以阳性或强阳性表达为主，棕黄色颗粒集中于胞质，胞核少量表达，明显高于对照组，差异有非常显著性（P<0.001）。
    
　　表1 不同缺氧时间Epo在卵巢癌细胞系中的表达 （略）

　　注:同一时间段内缺氧组与有氧组比较均P<0.001;同一组内不同时间段比较无明显差异
    
　　表2 不同缺氧时间Epo mRNA在卵巢癌细胞系中的表达 （略）

　　注:同一时间段内缺氧组与有氧组比较均P<0.001;同一组内不同时间段比较无明显差异
    
　　3 讨论
    
　　Epo是一种糖蛋白细胞因子，分子量34kD，由165个氨基酸组成，其基因位于19号染色体短臂。Epo早期由胎肝产生，后逐渐转移至肾脏，出生后主要由肾小管间质细胞分泌。当机体缺氧时，肾小管间质细胞周围氧分压下降，改变了胞浆中的还原状态后启动缺氧诱导因子（HIF-1）最终造 成Epo表达增多。Zaman等 ［2］ 进一步研究证实，在Epo基因的3′-端存在低氧诱导增强子，而在5′-端旁侧序列上含有转录因子的结合位点，低氧条件下，这些顺势调节元件与细胞核内反式作用因子特异性结合，相互作用致Epo基因表达增强。低氧还可能通过增加中间代谢产物前列腺素、腺苷酸的局部浓度，提高细胞内第二信使的水平，加强了Epo的基因转录。
   
　　本结果通过免疫细胞化学的方法鉴定卵巢癌细胞系3AO中Epo的表达情况，发现在正常条件培养的3AO细胞存在Epo的少量表达，主要集中于卵巢癌细胞浆中及核膜上，并且在缺氧条件下表达明显增高，据此我们可以认为Epo在卵巢癌细胞系中的表达是一种自分泌，即作为内源性保护因子起作用，其平时处于静息状态或低表达，当组织受到外界不良刺激（缺氧）后会迅速高表达，来对抗缺氧的不良环境。
   
　　众所周知，大部分恶性肿瘤的发生是组织细胞丧失自发凋亡的能力形成所谓“永生化”细胞克隆，强大的抗凋亡能力也使其细胞快速、无限制的分裂增殖，导致其生物学的“恶性”行为。Epo的抗凋亡作用最先在研究其对中枢神经系统的作用时被发现。Bernaudin等 ［3］ 发现，大鼠大脑中动脉栓塞前24h脑室内注射Epo，可有效减少梗塞面积，且存在剂量依赖效应;Juul等 ［4］ 在体外缺氧条件下培养人类神经元，加入生理剂量的人基因重组Epo（rHuEpo）后细胞的DNA断裂现象明显被抑制。可见，Epo在缺氧条件下抑制正常组织细胞凋亡的作用被确定。本实验提示我们，对于缺氧环境中体外培养的卵巢癌细胞，Epo作为始动因子，迅速表达，也可能发挥着重要的抗凋亡作用。
   
　　缺氧是体内恶性肿瘤微环境的重要特征，也是引起放化疗耐受的重要因素，同其他抗凋亡因子一样，Epo只是暂时性的阻断细胞死亡，尽量降低缺氧、缺血所造成的组织损伤，将坏死过程推迟，本实验中我们也未发现Epo的表达与缺氧持续时间的相关关系。如不能彻底解除缺氧缺血，细胞死亡仍难避免。新的血管生成就成为肿瘤细胞存活、瘤体生长所必需。研究证实，Epo还具有促进新生血管生成的作用，且其促血管生成作用与目前公认的最重要、作用最强的促血管生成因子VEGF作用相当，因此被一些学者认为是一种新的强效促血管生成因子 ［5］ 。
   
　　血管生成及抗凋亡是肿瘤维持恶性生长的重要保证，我们在本实验中初步证实了卵巢癌细胞系中存在Epo的表达且可被缺氧所诱导加强;Yasuda等 ［6］ 也发现，Epo及其受体在女性生殖系恶性肿瘤中mRNA的表达高于正常组织，因此我们认为Epo与卵巢癌的生长发生具有密切关系，搞清其如何在卵巢癌中发挥抗凋亡、促血管生成作用，将对卵巢癌的预防治疗具有相当大的实用价值，这将是我们下一步研究的重点。
     
　　参考文献
    
　　1 Watanabe H，Kanzaki H，Narukawa S.Bcl-2and Fas expression in eutopic and ectopic human endometrium during the menstrual cycle in relation to endometrial cell apoptosis.Am J Obstet Gynecol，1997Feb，176（2）:360-368.
   
　　2 Zaman K，Ryu H，Hall D，et al.Protection from oxidative stress-in-duced apoptosis in cortical neuronal cultures by iron chelators is associ-ated with enhanced DNA binding of hypoxia-inducible factor-1and ATF-1/CREB and increased expression of glycolytic enzymes，p21［waf1/cip1］，and erythropoietin.J Neurosci，1999，19（22）:9821-9830.
   
　　3 Bernaudin M，Marti HH，Roussel S，et al.Potential role for erythropoi-etin in focal permanent cerebral ischemia in mice.J Cereb Blood Flow Metab，1999，19（6）:643-651.
   
　　4 Juul SE，Anderdon DK，Li Y，et al.Erythropoietin and erythropoietin re-ceptor in the developing human central nervous system.Pediatr Res，1998，43（1）:40-49.
   
　　5 Jaquet K，Krause K，Tawakol-Khodai M，Erythropoietin and VEGF exhibit equal angiogenic potential.Microvasc Res，2002，64（2）:326-333.
   
　　6 Yasuda Y，Fujita Y，Masuda S，et al.Carcinogenesis，2002，23（11）:1997-2005. 

　　作者单位:710032陕西西安第四军医大学西京医院妇产科（ △ 通讯作者）
   
　　　　　　　721006陕西宝鸡解放军第537医院妇产科