胂酸基乙酸（ASAC）在荷H22肝癌小鼠体内的抑癌作用

　　【摘要】 目的  研究胂酸基乙酸（Arsenacetylic acid，ASAC）对H22肝癌荷瘤小鼠移植瘤的抑制作用。 方法  以尾静脉注射方式，观察ASAC对昆明小鼠的急性毒性作用并求出LD50。再以小鼠肝癌H22细胞株为研究对象，观察静脉注射ASAC的剂量分别为LD50的1/3、1/6、1/12时，ASAC对H22肝癌在小鼠体内生长的抑制作用及其毒副反应。 结果  ASAC静脉注射260mg/kg、130mg/kg、65mg/kg均能在小鼠体内诱导肝癌细胞凋亡。在260mg/kg剂量组，凋亡诱导最明显，并有显著的抑制肿瘤生长的作用，抑瘤率为46.6%。经病理组织学检查显示260mg/kg和130mg/kg剂量组对心脏和肝脏有轻度毒性，但260mg/kg出现了小鼠中毒死亡的现象。 结论  ASAC对荷H22小鼠肿瘤有一定的治疗作用，但存在最适剂量问题。其抑瘤机制还未探明，但诱导凋亡和分化可能是ASAC起到的主要作用。
       
      
　　Inhibition effect of arsenacetylic acid on experimental H22hepatoma bearing mice in vivo
     
　　Guo Lixia，Wang Yuanliang，Xiao Xu，et al.
   
　　Bioengineering College of Chongqing University，Key Laboratory of Biomechanics and Tissue Engineering under Ministry of Education，Chongqing400044.
   
　　【Abstract】 Objective To investigate the antitumor effects of arsenacetylic acid（ASAC）on solid tumor in vi-vo，the transplanted H22hepatoma of mice were treated with various dosages of ASAC.Methods After ASAC were injected via tail vein，acute toxicity were observed and obtained LD50.Hepatic carcinoma cells were transplanted sub-cutaneously to Kunming mice to produce tumor.The tumor inhibition rate in vivo was observed after intraperitoneally administering of ASAC.The histopathologic change in the tumor tissue，and the toxicity of ASAC to the heart，liver，spleen and kidney of the host mice were also investigated.Results At the dose of250mg/kg，130mg/kg，65mg/kg，ASAC induced apoptosis in hepatic carcinoma cells.ASAC of260mg/kg also induced the cancer cell differentiation and inhibited gross tumor growth，with the inhibition rate of46.6%.Some pathologic changes in cardia and liver tissue were recognized of at the dose of260mg/kg and130mg/kg.And it is lethal to the mice at the dose of260mg/kg.Con-clusion ASAC may have a potential therapeutic effect on hepatic carcinoma at suitable dosage.The mechanism of an-titumor activity may be due，at least in part，to the induction of apoptosis and differentiation in cancer cell.
     
　　Key words tumor bearing mice ASAC liver cancer pathology pharmacology apoptosis
      
　　抗癌是医学面临人体疾病治疗的一项重大任务。砷剂，可能成为一类新型的抗癌药物。其中As 2 O 3 （砒霜的主要成份）已经成功地应用于人类白血病的治疗 ［1，2］ 。对美拉胂醇（melarsoprol） ［3］ ，氧苯胂 ［4，5］ ，四硫化四砷 ［6］ 等砷化合物进行了许多体内和体外的研究，但都因药物浓度超过了临床的应用范围，而未能应用于临床。为此，寻求新型砷化物，比三氧化二砷毒性低，且抗癌活性高，成为一项研究热点。我们合成了一系列砷化合物发现了一种毒性较低的新型脂肪族有机胂化合物，胂酸基乙酸（ASAC）。体外实验表明 ［7］ ，ASAC对人肝实体瘤细胞株SMMC-7721有抑制细胞增殖、促进细胞凋亡的作用，且作用明显高于三氧化二砷。本文通过观察ASAC对H22肝癌荷瘤小鼠的移植瘤生长的抑制作用，继续探讨ASAC对机体内实体瘤的抑制作用。
  
　　1 材料与方法
    
　　1.1 动物饲养 昆明种小鼠购于重庆中药研究实验动物研究所，鼠龄5～6周，体重20～24g，批号:030202。饲养于恒温（25℃）、恒湿（40%～50%）的层流架中，给以经高温灭菌的标准饲养和水，动物饲养合格证:SCXK（渝）20020004。

　　1.2 瘤株 肝癌（H22）腹水型种鼠由重庆中药研究院药理室提供。
   
　　1.3 药物 胂酸基乙酸（ASAC）:重庆大学生物工程学院提供。环磷酰胺注射液（CY）:上海华联制药有限公司产品（批号:021102）。
   
　　1.4 急性毒性实验 经过预实验后，确定给药范围。然后取20～24g的昆明种小鼠70只，雌雄各半，随机分为7组，每组10只，ASAC设置7个剂量组，分别为325.00mg/kg、433.35mg/kg、577.80mg/kg、770.35mg/kg、1027.15mg/kg、1369.55mg/kg、1826.05mg/kg，一次性静脉注射给药，每只小鼠0.2ml。给药后观察7天，每天记录小鼠一般状况和死亡情况，死亡动物及时尸检，肉眼观察有明显异常者，送病理检查。以7天内动物死亡数为准，按点斜法求出小鼠静脉注射ASAC的LD50值。
   
　　1.5 抑瘤实验 实验重复3次，每次在无菌条件下抽取腹腔保种7天生长良好的肝癌腹水型种鼠的腹水，用无菌生理盐水稀释成1:10的肿瘤细胞混悬液，细胞计数为10 7 个瘤细胞/ml，于每只实验的单一雄性小鼠右腋皮下接种0.2ml（2×10 6 个瘤细胞/只）。接种后的小鼠随机分成5组，即（1）阴性对照组:生理盐水（NS）;（2）阳性对照组:CY40mg/kg;（3）ASAC高剂量组:LD50的1/3;（4）ASAC中剂量组:LD50的1/6;（5）ASAC低剂量组:LD50的1/12。NS组20只动物，其余每组10只。接种后24h开始静注给药，每10g为0.1ml，药物组每天给药一次，连续给药7天，阴性对照组给相应体积的NS液，阳性对照组（CY组）间日给药一次，末次给药后停药1天，脱颈处死动物，进行相关检查与分析。
   
　　1.6 观察指标 计算抑瘤率:治疗结束后，动物脱颈处死，称体重，剥离肿瘤并称瘤重。以抑瘤率（%）来判断抑瘤作用，公式如下:抑瘤率（%）=（对照组平均瘤重-给药组平均瘤重）/对照组平组瘤重×100%
   
　　以两样本间t检验比较用药组与对照组的差异。
   
　　计算脏器指数:剖取小鼠心、肝、脾、肾，分别称重，计算脏器指数，公式如下:脏器指数（%）=脏器的重量/体重×100%
   
　　移植瘤组织病理学观察:取移植瘤固定于10%的甲醛溶液中，石蜡包埋、切片、HE染色，光镜观察。
   
　　ASAC对荷瘤小鼠心、肝、脾、肾组织的毒性作用观察:
    
　　将实验组小鼠的心、肝、脾、肾组织固定、石蜡包埋、4μm切片、HE染色，光镜下观察药物对脏器的影响。

　　2 结果
    
　　2.1 急性毒性实验结果 小鼠静脉注射一次给不同剂量的ASAC后，随着剂量的增加，小鼠死亡数目增加。1826.05mg/kg组小鼠用药2天后全部死亡（100%），小鼠毛色无光泽，尾、口、足爪产生青紫色，起初深呼吸，伴随着喘息声，呼吸频率减慢，随后呼吸急促，呼吸变浅，频率加快，抽搐，直至心跳停止，死亡。解剖后肉眼观察，重要脏器未见明显水肿、淤血等病理变化。325.00g/kg组小鼠死亡1只（10%）。小鼠静脉注射ASAC的LD50为（727.78±143.77）mg/kg。
   
　　2.2 抑瘤实验结果 各实验组小鼠用药后体重均有较明显的增加，移植瘤在给药3天内生长迅速，以后生长相对缓慢，所有小鼠全部成瘤。与阴性对照组比较，3次实验各给药组的瘤重均显著减轻（P<0.01），3次重复实验的结果取其平均值，见表1。ASAC对H22有显著的抑制作用，高、中、低剂量组的抑制率分别为46.6%、46.3%、32.5%（P<0.001），相对于对照组差异有非常显著意义。不同剂量组并未出现明显的量效关系（P>0.05）。CY的抑瘤率为60.7%（P<0.001），相对于对照组有极显著意义。高剂量组的ASAC用药3天后部分动物出现了毒性反应，主要表现为小鼠活动不自主，后腿无力，拖步向前。随即高剂量组停药1天，改为隔天给药。重复3次的实验都出现高剂量组最终死亡1只小鼠（10%），符合药理学实验要求。其它剂量组均未出现毒性反应。
    
　　表1 静脉注射给药方式的ASAC对H22肝癌荷瘤小鼠移植瘤的抑制作用（略）
    
　　注:与阴性对照组相比较: ** P<0.001;ASAC组间比较: * P>0.05

　　2.3 脏器指数结果 脏器指数计算显示，ASAC各剂量组的心、肝、肾的脏器指数相对于阴性对照组并无明显的差异，但是低剂量组的ASAC的脾重指数有明显的升高，相对于阴性对照组的脾重指数0.53%上升到0.88%，而CY组的脾重指数为0.19%，低于阴性对照组的脾重指数。
   
　　2.4 移植瘤组织病理学变化 各组瘤组织，包括阴性对照组、阳性对照组和ASAC的各个剂量组，均见瘤细胞浸润脂肪及横纹肌组织。光镜下阴性对照组的瘤细胞生长旺盛，紧密排列成巢状或条索状，瘤细胞核呈圆形或卵圆形，核分裂多见，凋亡细胞偶见（图1）。ASAC组中，尤其是中剂量组，肿瘤组织坏死面积扩大，呈片状、分隔状坏死，瘤细胞密度降低，凋亡细胞明显增多，可见细胞皱缩、核固缩或碎裂，胞浆出现空泡变形（图3～4）。阳性对照比ASAC组瘤组织凋亡更为明显（图2）。
   
　　2.5 各主要脏器的病理检查 阴性对照组心、肝、脾、肾检查未见明显异常。ASAC组心脏均未见明显异常。高剂量和中剂量的ASAC组肝细胞有明显的颗粒样变性（图5），低剂量组未见明显的异常。高剂量ASAC组脾脏散在灶性区域组织退变（图6），中、低剂量组未见明显异常。高、中剂量ASAC组个别肾脏散在灶性区域肾小管变性，肾小球系增生，毛细血管管腔开放（图7）。阳性对照肝细胞有明显的胞浆疏松，呈颗粒样变性（图8），而脾脏、心、肾未见明显异常。
    
　　3 讨论
    
　　早在十余年前就有用牛黄解毒片（含雄黄）及雄黄治疗慢性粒细胞型白血病的报道。但是这些砷剂无论是在体外还是体内，其药物浓度均超过了临床的要求，我们力求寻找一种有机胂，达到降低毒性、提高疗效的目的。动物移植性肿瘤的实验方法是通过对动物一般状况的观察，体重变化及死亡率，来判断在动物的耐受剂量下，药物是否有明显的抑制肿瘤生长的作用，这是任何体外实验所不能替代的 ［8］ ，本实验就是根据这一原理制成H22肝癌荷瘤小鼠模型，来研究ASAC在体内的抗肝癌作用。
   
　　As 2 O 3 是一剧毒药物，其急性毒性作用，4μmol/g有20%，8μmol/g有80%小鼠死亡。而静脉注射ASAC的急性毒性实验结果表明，ASAC的半数致死剂量（727.78mg/kg）明显的高于As 2 O 3 ，砷剂的毒性大幅下降。
   
　　关于抑癌率，Chen ［9］ 建立小鼠实体型肝癌移植瘤模型，静注As 2 O 3 2.0mg/kg的抑制率为31.63%，本实验的结果表明，中、低剂量组对H22肝癌荷瘤小鼠移植瘤都有明显的抑瘤作用，抑瘤率达到46.3%和32.5%，且耐受性好，没有出现小鼠的毒性反应。而高剂量组部分出现了毒性反应，导致10%的小鼠死亡，其抑瘤率为46.6%，推测是由于毒性反应出现后改为隔天给药导致有效药物浓度的降低所至。环磷酰胺（CTX）是化疗的有效药物，其在体内经氧化、裂环、分解出有强大作用的磷酰胺氮芥，后者作用于DNA可形成交叉联结或引起脱嘌呤作用，使DNA链断裂，造成DNA结构和功能的损害，进而导致细胞死亡 ［10］ ，但是CY又可引起基体免疫抑制和致性腺损伤 ［11］ ，本实验的脏器指数显示，CY对脾脏的影响较大，ASAC基本上无影响。各个脏器的病理学检测也表明，CY对肝和脾脏的损伤较大，对小鼠造血系统严重的损伤抑制。而对于ASAC，一般认为由于砷在肝蓄积和解毒，肝细胞首当其毒性作用;肾脏是砷主要排泄器官，故肾小管上皮也受其损伤，而此次并无明显的作用，故尚需进一步研究。
   
　　总之，适当浓度的ASAC不仅降低了砷剂的毒性，而且对H22肝癌荷瘤小鼠的移植瘤有较好的抑制作用。药物采用静脉注射的方法，肿瘤明显缩小，有统计学显著意义。本实验提示，在临床应用前探索ASAC最高的抑瘤率及最低毒性的合适剂量具有重要的意义。虽然用药后低剂量的ASAC使小鼠脾重相对增加，但免疫机制的干预作用仍需进一步明确，ASAC对免疫功能的影响值得进一步研究。

　　（本文图片见封三）（略）
     
　　参考文献
    
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　　2 Shen ZX，Chen G，Ni JH，et al.Use of arsenic trioxide（As 2 O 3 ）in the treatment of acute promyelocytic leukemia（APL）.Ⅱclinical efficacy and pharmackinetics.Blood，1997，89:3354-3360.
   
　　3 Soignet S L，Tong W P，Hirschfeld S，et al.Clinical study of an organic arsenical，melarsoprol，in patients with advanced leukemia.Cancer Chemother Pharmacol，1999，44（5）:417-421.
   
　　4 Le C，Maridonneau P.Complete and reversible inhibition of NADPH ox-didase in human neutrophils by phenylarsine oxide at a step distal to membrane translocation of the enzyme subunits.J Biol Chem，1995，270（5）:2067-2073.
   
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　　7 黄凤玲，王远亮，陈春晓，等.三氧化二砷和胂酸基乙酸体外抗癌作用的比较.癌症，2002，21（4）:395-400.
   
　　8 徐叔云.药理实验方法学.第三版.北京:人民卫生出版社，2002，1757.
   
　　9 Chen H，Qin S，Pan Q.Antitumor effect of arsenic trioxide on mice ex-perimental liver cancer.Chin J Hepatol，2000，8（1）:27-29.
   
　　10 江明性.药理学.第三版.北京:人民卫生出版社，1990，393.
   
　　11 Velez de ca callel JF.Reproduction effects of the anticancer drug cy-clophosphamide in male rats at different ages.Arch Andr，1989，2:251. 

　　* 基金项目:国家自然科学基金资助项目（编号:30300084）
   
　　作者单位:400044重庆大学生物工程学院（生物力学与组织工程教育部重点实验室）