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【摘要】 目的 研究枸杞多糖对诱导人前列腺癌PC-3细胞凋亡及相关蛋白Bcl-2和Bax表达的影响。 方法 体外培养的人前列腺癌PC-3细胞经枸杞多糖作用后，采用MTT法测定细胞的增殖情况。采用TUNEL观察PC-3细胞凋亡的变化，用免疫组化法检测其Bcl-2和Bax蛋白的表达。 结果 一定剂量的枸杞多糖可明显抑制PC-3细胞的生长，并能诱导人前列腺癌PC-3细胞凋亡，凋亡率为41.5%，同时PC-3细胞Bcl-2/Bax蛋白比值显著下降，呈明显的剂量/效应关系。 结论 枸杞多糖能诱导人前列腺癌PC-3细胞的凋亡，其机制与调节人前列腺癌PC-3细胞Bcl-2和Bax蛋白表达有关。
【关键词】 枸杞多糖;人前列腺癌细胞;细胞凋亡;Bcl-2;Bax
Effect of Lycium barbarum polysaccharides on human prostatic cancer cell apop-tosis and apoptosis-related gene expression
LI Zhuo-neng，LUO Qiong，YANGMing-liang，et al.
Department of Hygiene，School of Public Health，Wuhan University，Wuhan430071，China
【Abstract】 Objective The aim of this study was to investigate the influence of Lycium barbarum polysaccharides（LBP）on human prostatic cancer cell line PC-3and its Bcl-2and Bax expression.Methods We cultured human prostate cancer PC-3cell in vitro and added the LBP to the medium at different concentrations，the MTT assay was used to measure the proliferation of PC-3cell.TUNEL was used to investigate the effects of LBP on PC-3cell apoptosis and immunohistochemical technique was used to detect the Bcl-2and the Bax expression.Results LBP could inhibit the growth of PC-3cell line.LBP can induce apoptosis and the apoptosis rate is41.5%，the ratio of Bcl-2/Bax protein decreased significantly with a dose-effect relationship.Conclusion LBP inhibits PC-3cell line in vitro，and the mechanisms may be related to its influence on the cell cycle and inducing of apoptosis.
【Key words】 lycium barbarum polysaccharide;human prostatic cancer cell;apoptosis;Bcl-2;Bax
随着经济水平的日益改善，人们的生活方式有了巨大的改变，同时人均寿命的延长，前列腺癌的发病率有日益增多的趋势 ［1］ ，我国前列腺癌的发病率约为2.41/10万男性人口 ［2］ 。枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharides，LBP）是枸杞子（Fructus Lycii）的提取物，具有抗肿瘤功能 ［3］ 及多种药理作用和生物活性功能 ［4］ ，并能诱导人前列腺癌PC-3细胞凋亡从而抑制其增殖 ［5］ 。然而其诱导前列腺癌PC-3细胞凋亡的机制还不明了。本文拟进一步探讨枸杞多糖对人前列腺癌PC-3细胞凋亡及相关蛋白Bcl-2和Bax表达的影响，以探讨枸杞多糖抗前列腺癌的可能机制。
1 材料与方法
1.1 试品及试剂
1.1.1 枸杞多糖 由本实验室制备。
1.1.2 细胞株及培养条件 雄激素不依赖型人前列腺癌细胞株PC-3由华中科技大学同济医学院提供，在含体积分数为10%的小牛血清中加入双抗的F12培养液（Gibco），37℃，5%CO 2 培养。
1.2 方法
1.2.1 实验分组及处理 实验设1个空白对照组和5个不同浓度实验组，分别为LBP100μg/ml、LBP200μg/ml、LBP400μg/ml、LBP800μg/ml和LBP1000μg/ml。取对数生长期的PC-3细胞1×10 4 个/ml接种于25ml的培养瓶培养，24h后加入前述不同浓度的LBP，作用48h后，胰酶消化离心，将细胞悬浮于PBS中，调浓度为1×10 6 个/ml细胞悬液，备用。
1.2.2 原位末端标记法（TUNEL） 由武汉博士德公司提供TUNEL检测试剂盒。光镜下，胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。随机计数200个细胞，算出阳性细胞率。
1.2.3 Bcl-2和Bax蛋白检测 按成套Bcl-2和Bax蛋白免疫组化染色试剂盒（武汉博士德公司）说明操作。光镜下观察胞浆、胞膜出现棕褐色的为阳性细胞，随机计数200个细胞，算出阳性细胞率。
1.3 统计学方法 所有的数据均用ˉx±s表示，采用SPSS软件包分析数据，各组间指数的比较采用单因素方差分析和t检验。
2 结果
2.1 枸杞多糖对人前列腺癌PC-3细胞生长的抑制作用 不同浓度的枸杞多糖对体外培养的PC-3细胞有抑制作用，并随剂量的增加其抑制作用加强，最大抑制率可达到87.84%。与对照组比较100μg/ml与200μg/ml组P<0.05，差异有显著性;400μg/ml、800μg/ml、1000μg/ml组P<0.01，差异有极显著性，结果见表1。
表1 枸杞多糖对人前列腺癌细胞PC-3细胞增殖的抑制作用 （略）
2.2 原位（缺口）末端标记法（TUNEL）检测细胞凋亡 形态学观察见TUNEL阳性细胞及凋亡细胞核染呈棕褐色，具有典型凋亡特征，表现为细胞缩小、核浓缩、核碎裂等。对照组的凋亡细胞明显少于试验组细胞。由表2可知，试验组PC-3细胞凋亡率明显比对照组高（P<0.01）;其中 1000μg/ml组的凋亡率最高（41.5%）。
表2 枸杞多糖对PC-3细胞凋亡作用TUNEL检测结果 （略）
2.3 凋亡相关基因Bcl-2、Bax表达的检测 Bcl-2、Bax阳性表达的细胞可见明显的黄棕色细胞轮廓及黄染的胞浆。各实验组的凋亡抑制蛋白Bcl-2表达均比对照组低，而促凋亡蛋白Bax的表达比对照组强。由表3可更清楚的知道Bcl-2和Bax蛋白表达的变化:与空白对照组相比，各剂量组Bcl-2阳性反应物强度明显降低，染色变浅（P<0.01）。对照组的Bax表达最弱，与枸杞多糖实验各剂量组比较，除100μg/ml组外，差异明显（P<0.01）。
表3 枸杞多糖对PC-3细胞Bcl-2和Bax蛋白表达的影响 略
3 讨论
近十年来，国内外学者的大量研究证实，多糖可影响肿瘤的发生与发展，具有抗癌、抗突变作用 ［6］ ，有的多糖如银耳多糖、香菇多糖等，已成为国际上评价最高的抗癌药之一 ［7］ 。前列腺癌已经成为最常见的男性恶性肿瘤 ［8］ ，根治前列腺癌的关键在于抑制癌细胞 ［9］ 。
目前认为，肿瘤的发生和发展是一个复杂的多阶段的过程，实际是多种肿瘤相关基因表达失常或许多肿瘤抑制基因失活所致。这类基因的主要功能是参与细胞增殖、分化和衰亡即凋亡等基本生命过程的调控。当这类基因由于某种原因发生突变、重排、缺失、扩增而被异常激活或失活时，正常的受控增殖、分化或凋亡受到干扰，于是细胞无限增殖、分化受阻或寿命延长而形成肿瘤。因而研究肿瘤细胞中基因的变化，有助于从分子水平了解细胞癌变机制。凋亡抑制基因bcl-2及其表达蛋白能够抑制或阻断多种因素引起的细胞凋亡，而促凋亡基因bax是bcl-2家族的一个重要成员，恰恰与bcl-2有相反的生物效应，它的显著表达能促进细胞体的凋亡。在体内Bcl-2、Bax蛋白可形成异质二聚体，两者剂量的比率决定细胞凋亡的敏感性，当Bcl-2/Bax增大则细胞存活，反之则易凋亡 ［10，11］ 。
本项研究的结果表明Bcl-2/Bax蛋白表达比值越小的组凋亡越明显，且表现出明显的剂量依赖性。可以认为枸杞多糖可能是通过调节Bcl-2和Bax蛋白的表达而诱导肿瘤细胞的凋亡，进而起到了抗肿瘤的作用的。但LBP是通过何种途径来影响Bcl-2和Bax的表达，还有待于进一步的研究。
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基金项目:湖北省科技厅重点攻关课题（2001AA307B）;达能膳食营养研究与宣教基金（200305）
作者单位:430071湖北武汉，武汉大学公共卫生学院卫生学教研室
（编辑:李 弋）