癫痫发作敏感大鼠内嗅皮层GFAP免疫反应活性的变化

　　【摘要】 目的  探讨癫痫发作敏感大鼠内嗅皮层GFAP免疫反应活性的变化。 方法  用红藻氨酸（KA）10mg/kg（S.C）诱发大鼠出现癫痫发作1个月后，用免疫组化方法观察大鼠内嗅皮层（EC）神经胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）免疫反应活性的变化。 结果  发现EC区有大量GFAP免疫反应活性增强。 结论  这一现象可能与动物癫痫敏感性长期增强有关。

　　【关键词】  癫痫敏感性;红藻氨酸;神经原纤维酸性蛋白（GFAP）
         
　　The change of glial fibrillary acidi protein immunoreactivity in entorhinal cortex of seizure sensitive rats
     
　　CHENGWei-guo，ZHANG Jian-ping，WANG Bin，et al.

　　Department of Neurology，the First Hospital of Wuxi，Wuxi214001，China

    【Abstract】 Objective To study the change of glial fibrillary acidi protein immunoreactivity in entorhinal cortex of seizure sensitive rats.Methods Seizure episodes were induced by administration of kainic acid（10mg/kg s.c）in the Sprague-Dawley rats，one month later.The change of glial fibrillary acidi protein（GFAP）immunoreactivity in en-torhinal cortex（EC）of rats was examined by using immunocytochemical method.Results As compared with control group，the more intensive GFAP immunostainings were found in EC of experiment group.Conclusion The phe-nomenon may associated with the long-term enhancement of seizure susceptibility.

    【Key words】 seizure susceptibility;kainic acid;GFAP
      
　　癫痫是以反复发作的神经元异常放电所致的暂时性中枢神经系统功能失调为特征的一组疾病，KA癫痫模型以其行为和病理与人类颞叶癫痫极为相似的特点已被广泛用作人类颞叶癫痫的急性模型 ［1］ ，大量研究发现EC是癫痫的相关脑区 ［2］ 。本实验用免疫组化方法，结合行为学观察，研究EC的胶质细胞增生病理变化与癫痫敏感性增强的关系。
    
　　1 材料与方法
    
　　1.1 动物处理 本实验用体重为150～200g的SD雄性大鼠20只，由大连医科大学动物实验中心提供。按10mg/kg的剂量，颈部皮下注射KA，按Racine ［3］ 所描述的癫痫发作级别观察，选取癫痫发作严重程度达4～5级或伴有癫痫持续状态的大鼠10只作为实验组，饲养1个月。对照组动物10只，颈部皮下注射NS，1个月后用阈下剂量KA（5mg/kg）再次给实验组和对照组大鼠颈部皮下注射，检测癫痫发作敏感性的变化。

    1.2 免疫组化实验 动物经水合氯醛麻醉后，分别用1%和4%的多聚甲醛灌流，取脑放入4%的多聚甲醛中后固定，再换入25%蔗糖磷酸缓冲液过夜，用振动切片机切取厚度为50μm的脑片，进行下列免疫组化过程:（1）2%牛血清白蛋白（BSA）内孵育20min。（2）GFAP抗血清（1:500）孵育过夜，然后用PBS冲洗。（3）生物素—IgG（1:400），室温下孵育1h。（4）卵白素生物素复合物（A:B:PBS=1:1:400），振荡孵育2h。（5）二氨基联苯胺（DAB）法显色。（6）二甲苯透明，中性树脂封片。（空白对照脑片不加第一抗体）。
          
　　1.3 图像分档扫描 用HPIAS系列彩色病理图文分析系统进行EC脑片细胞计数，脑片的选取部位按George Paxinos&Charles Watson的大鼠脑图谱，先在10倍的物镜下观察，选取EC部位，EC位于人字缝尖后2～2.5mm，中线外5mm区域，然后在荧光屏上画出测量框的轮廓，测量框的面积为11297μm 2 ，宽度和高度分别为79μm和143μm，计算测量框内细胞的个数，在每张脑片的EC取三个部位计数，取平均值。

    1.4 统计学处理 免疫组化数据用均数±标准差（ˉx±s）表示，并输入计算机进行t检验，以P<0.05为差异有显著性指标。

　　2 结果
    
　　2.1 大鼠癫痫发作的行为变化 给实验组动物一次颈部皮下注射惊厥剂量KA（10mg/kg）后，30min内动物出现凝视和湿狗样抖动，30～120min内，出现时间依赖的癫痫行为，从面部抽搐开始（1级），逐渐波及颈部肌肉（2级），一侧肢体阵挛（3级），动物站立，双前肢阵挛（4级），失去平衡跌倒（5级），2h后动物反复自发出现1～5级癫痫发作，4h后癫痫发作减轻，次数减少，8h后基本停止。未出现0级与1级癫痫发作，2级癫痫发作1只，3级癫痫发作3只，4级癫痫发作5只，5级癫痫发作11只，5级中因癫痫持续状态死亡2只。成模率70%，死亡率10%。在1个月后给予阈下剂量KA（5mg/kg）时，实验组动物仍旧出现4～5级癫痫发作。而对照组未出现癫痫发作。

    2.2 癫痫大鼠EC处GFAP免疫反应阳性细胞的变化 GFAP免疫组织化学的结果显示，见表1，图1。与对照组相比，实验组大鼠，EC出现大量GFAP免疫反应阳性的星形胶质细胞，而且细胞体积变大，突起变长变粗，免疫染色强度明显增强，有的部位甚至有胶质瘢痕形成。
    
　　表1 两组大鼠GFAP细胞数比较　略
         
　　3 讨论
    
　　颞叶癫痫与边缘系统密切相关，EC是边缘系统的重要成分，电点燃及低Mg 2+ 的脑脊液刺激EC易产生癫痫样放电，并传递到海马 ［2］ ，提示EC是癫痫形成的相关脑区之一。

    研究证明，注射谷氨酸的结构类似物KA后可诱发动物出现癫痫发作，并出现类似人类颞叶癫痫的脑损伤 ［4］ ，Ben-Ari ［5］ 提出，KA诱发癫痫发作后数周，甚至1个月以后，动物可出现癫痫敏感性增强，本实验以前的工作证明癫痫敏感性长期增强是在KA后的5～7天 ［1］ 。

    本研究证明一次性给予KA后可诱发动物出现癫痫发作，1个月后，当给予阈下剂量的KA时，动物也出现明显的癫痫发作，说明动物的癫痫敏感性增高，并且在EC出现大量的星形胶质细胞增生，体积变大，染色加深。

    星形胶质细胞可以摄取GABA，参与谷氨酸代谢，合成与分泌NGF等神经营养因子，主动摄取K + ，维持Na + /K + 的平衡，对神经元的活动起调节作用，GFAP不仅是其特有的标志物，而且也是神经元受损时星形胶质细胞出现胶质反应，成为反应性星形胶质细胞的生物化学基础 ［6］ 。EC脑损伤伴星形胶质细胞的增生肥大的机理不清楚，体外研究证明可能与癫痫发作过程中的细胞外高K + 及胶质细胞从突触间隙大量摄取谷氨酸及门冬氨酸对它本身产生的胶质毒反应有关 ［7］ ，也与受损的脑组织产生多种促进星形胶质细胞GFAP mRNA表达增高的因子有关 ［8］ 。EC处虽然有大量的反应性星形胶质细胞，但是反应性星形胶质细胞不能及时清除神经元兴奋时释放的K + ，神经元细胞外Na + /K + 浓度平衡失调，使神经元兴奋阈值降低，易过度放电，Chow证明，增生的星形胶质细胞离子转运功能有异常 ［9］ ，Janigro研究发现，抑制星形胶质细胞对K + 的重摄取，可产生癫痫样放电 ［10］ ;增生的星形胶质细胞通过释放谷氨酸和NO等免疫介质对周围的神经元有直接的损害作用;同时激活的星形胶质细胞具有促进轴突发芽，突触重建的作用 ［7］ 。

    EC与海马之间存在兴奋性三级突触联系，这一回路的过度激活易引起癫痫发作 ［1］ ，当EC胶质细胞增生时，可能引起神经元微环境的电解质与神经递质失衡，有助于神经元异常放电，使冲动信息由EC传递到海马，促进反复的自发性癫痫活动的产生与发展。这可能是癫痫敏感性增强并且长期存在，以至于终身反复癫痫发作的重要原因之一。 （本文图片略）

　　【参考文献】
    
　　1 孙艺平，宫瑾，张万琴.海人酸诱发癫痫敏感性长期增强的形成与维持.中国应用生理学杂志，1995，11（4）:354-356.

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　　5 Ben-Ari Y.Limbic seizures and brain damage produced by kainic acid，mechanisms and relevance to human temporal lobe epilepsy.Neu-roscience，1985，14:375.

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    8 李立新，叶诸榕.反应性星形胶质化的形成机制及研究进展.国外医学·生理、病理科学与临床分册，1996，16（4）:278-280.

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    10 Janigro D，Gasparini SD，Ambrosio R，et al.Reduction of K+ uptake in glia prevents long-term depression maintenance and causes epilpti-form activity.J Neurosci，1997，17（8）:2813.

　　作者单位:1　214001江苏无锡，无锡市第一人民医院
  
　　　　　　 2　116023辽宁大连，大连医科大学生理教研室

　　（编辑:悦 铭）