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【摘要】 目的 研究甲壳胺-生物止血愈合海绵潜在的皮肤致敏性。方法 按照GB/T16886.12-2005《医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品》的规定制备甲壳胺-生物止血愈合海绵检验液，将检验液按照GB/T16886.10-2005《医疗器械生物学评价 第10部分：刺激与致敏试验》中的规定进行皮肤致敏试验。结果 本项试验中，甲壳胺-生物止血愈合海绵皮肤致敏性为1级（与阴性对照相同）。结论 本产品无潜在的皮肤致敏性。
【关键词】 甲壳胺-生物止血愈合海绵；皮肤致敏；生物学评价
Study on potential sensitiveness of chitosan bio-sponge for healing of skin
HAO Shu-bin，ZHU Xue-tao，HUANG Jing-chun，et al.School of Public Health，Shandong University，Jinan 250012，China
【Abstract】 Objective To study the potential sensitiveness of chitosan bio-sponge for healing. Methods Testing extractions was prepared according to biological evaluation of medical devices-Part 12-2005: sample preparation and reference materials and then tested according to biological evaluation of medical devices-Part 10-2005: tests for irritation and sensitization.Results The sensitization potential of the test article in this study was classified as grade 1(no difference with negative control). Conclusion No potential sensitiveness on skin was showed.
【Key words】 chitosan bio-sponge for healing; sensitization on skin; biological evaluation
甲壳胺是一种阳离子高分子电解质，系指一系列具有不同分子量(50～2000kDa)、粘度和脱乙酰度(40%～98%)的甲壳胺聚合物［1］。主要由甲壳动物如虾、蟹的壳体中提取而来，其前体为甲壳质。甲壳质是一种天然多糖物质，具有较好的晶状结构和较多的氢键，溶解性能很差，但其经脱乙酰化成为甲壳胺(也称脱乙酰甲壳素)后，溶解性能大大增强。甲壳胺最早应用于工业领域。目前由于甲壳胺具有良好的生物相容性和适应性，并具有消炎、止血、镇痛和促进机体组织生长等功能，可促进伤口愈合，因此被公认为保护伤口的理想材料［1］，可作为手术缝合线、人工肾膜和人造皮肤等。除此之外，甲壳胺在医学领域还用于强化免疫、抑制老化、减肥、调节血脂、调节血糖的保健食品以及化妆品等。作为与组织和血液接触的医疗器械，根据GB/T16886.1-2000《医疗器械生物学评价第1部分:评价与试验》［2］，应当对其潜在的皮肤致敏作用进行试验并进行生物学评价。本研究采用最大剂量法，在试验中增加了“未诱导阳性对照组”［3］，排除了因阳性对照物引起刺激而造成的假致敏阳性，该设计使整个试验更具有合理性。
1 试验材料
1.1 样品 甲壳胺-生物止血愈合海绵(由青岛海大倍尔信生物科技有限公司提供)。
1.2 试验动物 健康，初成年的白化豚鼠(306～367g)，来源于上海申旺实业养殖场，动物许可证号［SCXK（沪）2002-0011］，动物级别一级。
1.3 试剂 1-氯-2，4二硝苯（DNCB）(分析纯)、完全弗氏佐剂（FCA）(分析纯)、十二烷基磺酸钠（SDS）(分析纯)、生理盐水（SC）、棉籽油（cottonseed oil）。
2 试验设计
采用最大剂量法［4～6］，动物的分组、给药途径、给药日程见表1。
表1 试验设计 略
3 试验过程
3.1 浸提液制备 按每6cm2甲壳胺-生物止血愈合海绵加1ml溶剂（生理盐水），于37℃放置72h制备浸提液［7］。
3.2 第一步诱导
3.2.1 试验组 按图1所示点位(a、b和c)，在每只动物去毛的肩胛骨内侧部位成对皮内注射0.1ml。
3.2.2 阳性对照组 与试验组相似。但图1中的b和c中的浸提液被0.1%DNCB代替。
3.2.3 阴性对照组 与试验组相似。但图1中的b和c中的浸提液被溶剂代替。
3.3 第二步诱导 皮内诱导阶段之6天后，因试验组和阴性对照组未引起皮肤刺激，在试验组和阴性对照组的注射点用10%十二烷基磺酸钠（SDS）石蜡液预处理，按摩导入皮肤。24h后，将处理部位擦净，向每张20mm×40mm的滤纸上各加0.4ml 3.1中制备的浸提液后，局部贴敷于每只试验组动物的肩胛骨内侧的诱导注射点。用封闭式包扎带固定，并于(48±2)h后除去包扎带和滤纸片。对照组动物使用相同的方法处理，但阳性对照组用0.1%DNCB而阴性对照组用溶剂代替浸提液。
图1 皮内注射点部位 略
3.4 激发阶段 如表2所示，局部诱导阶段13天后，将每只动物的腹部右侧约5cm×5cm的区域剪毛，第2天对全部试验动物和对照动物进行激发。向每张滤纸上各加0.3ml 3.1中制备的浸提液后，局部贴敷于每只试验组动物的腹部右侧去毛处，用封闭式包扎带固定，并于24h后除去包扎带和滤纸片。对照组动物使用相同的方法处理，但阳性对照组和未诱导阳性对照组用0.025%DNCB，而阴性对照组用溶剂(sc)代替浸提液。
按表2所示，将湿润的滤纸局部贴敷于每只动物的单侧腹部。用封闭式包扎带固定，并于(24±2)h后除去包扎带和滤纸片。
表2 激发 略
3.5 重复试验 以棉籽油代替生理盐水作为溶剂重复上述过程（3.1～3.4）。
4 动物观察
除去贴敷物后的24h、48h和72h分别观察试验组和对照组动物激发部位皮肤情况，按表3规定的分类系统，描述每一激发部位和每一观察时间皮肤红斑和水肿反应程度。
表3 皮肤反应分类系统 略
5 结果
在使用生理盐水和棉籽油阴性作为溶剂的两组试验中，对照组动物记分均＜1，未诱导阳性对照组动物记分均＜1，阳性对照组动物记分均＞1，试验组动物记分均＜1，所以在本项试验条件下，甲壳胺-生物止血愈合海绵无皮肤致敏作用。
6 讨论
医用敷料是一类用于各种创口表面进行临时覆盖、保护的医用材料，对于封闭创面，减少感染起着重要作用。一个理想的创面覆盖物应具备良好理化和生物学性能，且易于制备、灭菌、贮存及价廉等特点。近年来研究和发展的创面覆盖物主要有生物型的自体皮移植、异体皮移植、异种皮移植和羊膜等；合成材料覆盖物，如聚氨酯膜、人造皮肤等；生物材料覆盖物，如骨胶原、甲壳素/甲壳胺及其衍生物。
甲壳胺作为低等动物中的纤维组分，兼具高等动物组织中的胶原和高等植物纤维中纤维素两者的生物功能，因此，生物特性十分优异，主要表现为生物相容性好，生物活性优异，生物降解性好。另外，甲壳素普遍存在于虾蟹的外壳和昆虫等节肢动物的外壳中，资源丰富、分布广泛。因此甲壳胺是理想的医用敷料材料。
本研究所采用的研究方法为GB推荐的标准的刺激与致敏试验方法，重复性好、结果可信。研究的结果表明，甲壳胺-生物止血愈合海绵无潜在的致敏作用。但作为一种生物学材料，除了要对其进行致敏性研究外，还必须进行一系列的生物学试验和/或评价，如：细胞毒性、遗传毒性、植入、血液相容性、慢性毒性等，以证实产品的安全性，对此我们将继续进行深入研究。
【参考文献】
1 安富荣. 甲壳胺作为药用辅料的应用进展. 上海医院药学，1999，10(2): 23-27.
2 GB/T16886.1-2001《医疗器械生物学评价 第1部分：评价与试验》. 北京：中国标准出版社，2001.
3 朱雪涛，黄经春，王昕，等. 羟基磷灰石-胶原人工骨材料潜在皮肤致敏性研究. 中华中西医杂志，2003，4(17): 2574-2575.
4 Standard practice for testing guinea pigs for contact allergens: guinea pig maximization test. ASTM Standard F720-81.(Reapproved 1996.)
5 Wahlberg JE，Boman A. Guinea pig maximization test. curr Probl Dermatol，1985，14:59-106.
6 GB/T16886.10-2005《医疗器械生物学评价 第10部分：刺激与致敏试验》. 北京：中国标准出版社，2005.
7 GB/T16886.12-2005《医疗器械生物学评价 第12部分：样品制备与参照样品》. 北京：中国标准出版社，2005.
作者单位：1 250012 山东济南，山东大学公共卫生学院
2 250013 山东济南，国家食品药品监督管理局济南医疗器械产品质量监督检验中心
(编辑：宋 冰)