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【摘要】 目的 建立清火栀麦片中对穿心莲内酯及脱水穿心莲内酯测定的HPLC法。方法 外标法，DiamonsilTMC18色谱柱（150mm×4.6mm，5μm）;流动相：甲醇-0.4%冰醋酸水溶液（46：64）；检测波长225nm和250nm；流速1ml/min。结果 穿心莲内酯的线性范围为0.112～0.391μg（r=0.9997），平均回收率为99.8%，RSD=1.8% (n=5)；脱水穿心莲内酯的线性范围为0.221～0.773μg (r=0.9996)，平均回收率为98.7%，RSD=0.5% (n=5)。结论 方法准确、灵敏，可作为清火栀麦片中穿心莲内酯及脱水穿心莲内酯的定量分析方法。
【关键词】 片剂；穿心莲内酯；脱水穿心莲内酯；高效液相色谱
Determination of andrographolide，dehydroandrographolide in Qinghuozhimai tablets by HPLC
ZHAO Bao-hua，HE Xiu-xia，XU Li-zhen，et al.Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College，Beijing 100094，China
【Abstract】 Objective To determine the content of andrographolide、dehydroandrographolide in Qinghuozhimai tablets by HPLC. Methods An external standard method by HPLC with DiamonsilTMC18 column as fixed phase and methanol-0.4%HAC(46:64) as mobile phase was adopted. The detection wavelength was 225nm、250nm and the flow rate was 1.0ml/min.Results The linear range for andrographolide was 0.112～0.391μg(r=0.9997).The average recovery of tablets sample was 99.8% and RSD was 1.8% (n=5);the linear range for dehydroandrographolide was 0.221～0.773μg(r=0.9996). The average recovery of tablets sample was 98.7% and RSD was 0.5% (n=5).Conclusion The method is simple and accurate，which can be adoptable for quantitative analysis of andrographolide、dehydroandrographolide of Qinghuozhimai tablets.
【Key words】 tablets; andrographolide;dehydroandrographolide;HPLC
清火栀麦片［1］是由穿心莲［2］、栀子、麦冬三味药经提取精制而成，具有清热解毒，凉血消肿等功效，主要用于咽喉肿痛、发热、牙痛、目赤等。但其质量标准无两种有效成分的同时测定方法［3～5］。为完善质量控制标准，本文选择采用穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯作为测定对象，建立了用HPLC同时测定清火栀麦片中穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯的方法。
1 仪器、试剂和样品
Waters高效液相色谱仪，600型泵，996型紫外检测器，million2010数据处理系统。
甲醇（色谱纯），冰醋酸（分析纯），水为重蒸水；清火栀麦片由江西汇仁集团提供。穿心莲内酯（0797-200105）、脱水穿心莲内酯（854-9902）对照品由中国药品生物制品检定所提供，经高效液相色谱法归一化法测定纯度为99.5%和99.0%。
2 方法与结果
2.1 色谱条件 色谱柱DiamonsilTM（钻石），C18，150mm×4.6mm，5μm;流动相：甲醇-0.4%冰醋酸水溶液（46：64）；流速1ml/min；柱温25℃。检测波长225nm和250nm。
2.2 样品制备及方法可行性考察
2.2.1 对照品溶液 取穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯对照品适量，精密称定，甲醇溶解，制成浓度为穿心莲内酯20μg/ml和脱水穿心莲内酯50μg/ml的混合对照品溶液，备用。
2.2.2 样品溶液制备 取本品20片，除去糖衣，研细，混匀。取粉末约0.5g，精密称定，置25ml容量瓶中，加甲醇20ml，超声处理30min，放置至室温，用甲醇定容，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液即得。
2.2.3 阴性样品溶液制备 另取不含穿心莲药材的阴性样品*［*不含穿心莲药材的阴性样品：按清火栀麦片配方（删除穿心莲药材），采用该片剂制备工艺制得的样品］，照供试品溶液项下操作制备成阴性样品溶液。
2.2.4 测定方法 分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液10μl注入HPLC仪，绘制色谱图，穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的理论塔板数均不小于4000。样品中穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯与相近峰分离清晰完全，穿心莲内酯分离度为1.5，脱水穿心莲内酯分离度为2.0。且阴性样品在相同位置无干扰。见图1。
2.3 线性关系考察 分别精密吸取穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯混合对照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4ml，分别置10ml容量瓶中，甲醇稀释至刻度，混匀。穿心莲内酯对照品溶液浓度分别为11.16、16.74、22.32、27.90、33.48、39.06μg/ml，脱水穿心莲内酯对照品溶液浓度分别为22.08、33.12、44.16、55.20、66.24、77.28μg/ml，分别取10μl注入HPLC仪。以峰面积为纵坐标，对照品量为横坐标，绘制标准曲线，回归方程分别为穿心莲内酯：Y=2.19×106X-5.84×104，r=0.9997；脱水穿心莲内酯：Y=1.53×106X-5.10×103，r=0.9996。线性范围：穿心莲内酯：0.112～0.391μg；脱水穿心莲内酯：0.221～0.773μg。
2.4 仪器精密度和样品稳定性、重现性试验 在相同色谱条件下，分别精密吸取穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯对照品的混合溶液10μl，注入HPLC仪，重复进样5次，测定对照品溶液峰面积积分值，结果见表1。
表1 精密度试验测定结果 略
穿心莲内酯RSD=1.5%，脱水穿心莲内酯RSD=0.2%。
同一供试品溶液每次取10μl，每隔1h进样，共进样5次，测定峰面积积分值，穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯峰面积RSD分别为1.4%和0.8%，结果表明，样品在5h内稳定。见表2。
表2 稳定性试验测定结果 略
同一批样品5份，精密称定，按“样品溶液制备”项下操作，制备成供试品溶液，每份样品各进样10μl，测定穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯含量，其平均穿心莲内酯含量为0.0731%，RSD=1.1%；脱水穿心莲内酯含量为0.321%，RSD=0.6%。结果见表3。
表3 重复性试验测定结果 略
2.5 回收率试验 精密称取已知含量的样品5份，分别精密加入一定量的穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯对照品，按样品溶液制备和测定方法项下操作测定，结果穿心莲内酯平均回收率为99.8%，RSD=1.8%；脱水穿心莲内酯平均回收率为98.7%，RSD=0.5%(n=5)。测定结果见表4、5。
表4 穿心莲内酯回收率试验测定结果 略
表5 脱水穿心莲内酯回收率试验测定结果 略
2.6 样品测定 按样品溶液制备项制备供试品溶液后，精密吸取供试品溶液10μl，按上述色谱条件测定，用外标法计算清火栀麦片中穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯含量，结果见表6。
表6 清火栀麦片（糖衣）中穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯含量 （略）
3 讨论
3.1 穿心莲 为本方君药，穿心莲主要成分为穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯。本方法选择穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯为检测成分，共检测了10批成品的含量，结果表明该方法稳定可行，方法简便准确。
3.2 样品制备的最佳选择 (1)提取溶剂的选择:分别用甲醇、无水乙醇、95%乙醇作为提取溶剂进行了提取，检测结果表明，甲醇提取效果最好。(2)提取时间的选择：采用超声方法进行提取，选择不同时间提取后，进行检测，结果表明30min即可提取完全。
3.3 方法评析 本方法准确灵敏，可作为清火栀麦片中穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯的定量分析方法，为进一步制定清火栀麦片质量标准提供了依据，并对含有穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯的其他产品的检测也具有一定的参考价值。
【参考文献】
1 中华人民共和国卫生部药品标准.中药成方制剂，第13册.WS3-B-2617-97.
2 国家药典委员会.中华人民共和国药典.2000年版(一部).北京：化学工业出版社，2000，220-221.
3 屈喜玲.穿心莲浸膏胶囊中脱水穿心莲内酯的含量测定.中药材，2000，23(6):353-354.
4 黄捷.清火栀麦胶囊中穿心莲内酯的HPLC测定及稳定性考察.中国现代应用药学杂志，2000，17(3):227-229.
5 金海英，周秀芳，徐慧，等.穿心莲药材中穿心莲内酯的含量测定.中医药信息，2001，18(6):27.
作者单位： 100094 北京，中国协和医科大学、中国医学科学院药用植物研究所
(编辑：守 中)