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【摘要】 目的 评价益生菌对轻度溃疡性结肠炎的疗效，比较治疗前后肠道局部组织学及细胞因子表达的变化，初步探讨益生菌对肠黏膜免疫系统的影响。方法 随机给予轻度溃疡性结肠炎患者双歧三联活菌（商品名：培菲康）或SASP治疗，12周后评定临床疗效，并比较肠道组织学评分及肠黏膜促炎性细胞因子表达的变化。结果 临床疗效及组织学评分显示益生菌对轻度溃疡性结肠炎有效，在不同治疗组的溃疡性结肠炎患者肠黏膜促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β及IL-6的表达水平均较治疗前显著下降。结论 益生菌对轻度溃疡性结肠炎的临床治疗有效，可显著降低肠黏膜促炎性细胞因子的表达。
【关键词】 益生菌；溃疡性结肠炎；TNF-α；IL-1β；IL-6
Preliminary study of the effects of probiotics on ulcerative colitis
DING Wei-qun，RONG Lan，LIU Wei，et al.Department of Gastroenterology，Huashan Hospital，Fudan University，Shanghai 200040，China
【Abstract】 Objective To evaluate the clinical effects of probiotics on mild ulcerative colitis，changes of histologic inflammation scoring，levels of cytokines after treatment.Methods Patients were random divided into two groups which to receive sulfasalazine or probiotics(bifico).Efficacy，histologic inflammation scoring and mucosal levels of cytokines were analyzed after 12 wks treatment.Results Clinical efficacy and histologic inflammation scoring show beneficial effect of probiotics，and the expression of proinflammatory cytokines TNF-α，IL-1β，IL-6 decreased in colon.Conclusions Probiotics is effective in the management of mild ulcerative colitis，and decrease the level of proinflammatory cytokines in colon.
【Key words】 probiotics；ulcerative colitis；TNF-α；IL-1β；IL-6
非特异性炎症性肠病（溃疡性结肠炎和克罗恩病，IBD）近年来在我国的发病率有逐渐上升的趋势［1］。迄今其病因及发病机制尚未完全明确，但近年的一些研究结果取得某些重要进展，如对肠道感染的致病意义，特别是腔内正常菌群、细菌产物及其他抗原物质的作用以及黏膜免疫系统的深入研究，尤其是免疫调节所引起的各种细胞因子、炎症介质作用的研究。目前国外的一些研究更发现益生菌对炎症性肠病的治疗有益。本文通过临床观察培菲康治疗轻度溃疡性结肠炎的疗效以及比较患者肠黏膜细胞因子表达的变化来初步探讨益生菌对溃疡性结肠炎肠黏膜免疫系统的影响。
1 资料与方法
1.1 病例选择 2004年1月～2005年6月因下消化道症状如腹痛、腹泻、黏液血便、里急后重等在我院内镜室行肠镜检查的患者。所有病例的最后诊断均在排除细菌性痢疾、阿米巴痢疾、慢性血吸虫病、肠结核等感染性结肠炎及克罗恩病、缺血性结肠炎、放射性结肠炎等疾病的基础上经过结肠镜和病理证实为溃疡性结肠炎。
溃疡性结肠炎患者根据局部表现和全身表现进行临床严重程度分度，主要依据2000年在成都举行的全国炎症性肠病学术研讨会上制定的溃疡性结肠炎的诊断标准［2］。
1.2 分组方法 共有63例轻度溃疡性结肠炎病人随意分为试验组34例，对照组29例，男41例，女22例，年龄24～75岁，病程1个月～3年。
1.3 给药方法 试验开始前，必须停用一切影响溃疡性结肠炎的药物（包括激素、SASP片等），并征得病人同意方可纳入本试验。试验组口服双歧三联活菌（商品名：培菲康，上海医药有限公司信谊制药总厂，210mg/粒，每粒含长型双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌数分别不低于1.0×107CFU），每次4粒，1日3次。对照组口服SASP胶囊（上海三维制药有限公司，0.25g/粒）每次4粒，1日4次。疗程为12周。
2 观察指标
2.1 疗效评定标准 完全缓解：临床症状消失，结肠镜检查发现黏膜大致正常。有效：临床症状基本消失，结肠镜检查发现黏膜轻度炎症或假息肉形成。无效：经治疗后临床症状、内镜及病理检查等均无改善。 将完全缓解和有效组列为缓解组，无效组列为未缓解组。
2.2 实验室指标
2.2.1 肠道组织学炎症评分 所有研究对象常规进行肠道准备，然后行结肠镜检查。病变处结肠黏膜组织置于10%福尔马林固定置备，石蜡切片。行苏木精—伊红（HE）染色，以盲法观察。光镜下观察肠黏膜上皮损伤情况，参照文献方法给予评分［3］：0分：黏膜正常；1分：少量炎症细胞浸润；2分：明显的炎症细胞浸润；3分：明显的炎症细胞浸润同时伴有隐窝炎或隐窝脓肿；4分：明显的炎症细胞浸润同时伴有杯状细胞减少。
2.2.2 细胞因子测定 (1)标本采集：①所有研究对象常规进行肠道准备，然后行肠镜检查。在病变处取组织2块，立即置于10%福尔马林固定。②TNF-α、IL-1β及IL-6免疫组化：上述组织标本蜡块常规切片，脱蜡水化，依次滴加3%H2O2、正常小牛血清及鼠抗人TNF-α、IL-1β及IL-6单抗（购自Sigma公司，工作浓度1：200），Envision+/HRP染色，底物DAB显色，苏木素复染，最后封片，光镜观察。(2)结果评定：光镜下可见TNF-α、IL-1β及IL-6表达阳性的细胞，其胞质为棕黄色着色，背景为淡黄色。然后选取切片的右上、右下、左上、左下和中间5个视野，运用自动图像分析仪检测每个高倍视野内阳性强度均值和阳性比率（阳性比率=阳性细胞面积/阳性细胞面积+阴性细胞面积）。取其平均值，最后结果=平均阳性强度均值×平均阳性比率。
2.3 统计学方法 两组计量指标比较用t检验，计数指标比较用χ2检验。
3 结果
3.1 两组患者基本情况比较 经统计分析各组之间性别、年龄的构成差异均无显著性（P>0.05）。
3.2 两组疗效比较 对照组(SASP组)29例病人治疗12周后完全缓解6例，有效16例，无效7例，总有效率62.07%；试验组（益生菌组）34例病人12周后完全缓解14例，有效14例，无效6例，总有效率70.59%。两组总有效率比较无统计学意义（P>0.05）。见表1。表1 两组疗效的比较
3.3 肠道组织学炎症评分比较 光镜下可见病变黏膜表层糜烂，固有膜内有弥漫性、慢性炎症细胞及中性粒细胞、嗜酸性粒细胞浸润，隐窝有急性炎症细胞浸润，杯状细胞减少，腺管排列紊乱。经过治疗后，缓解组的肠道组织学炎症评分与治疗前比较差异有统计学意义（P<0.05）。益生菌组与SASP组的缓解组之间的炎症评分比较差异无统计学意义。见表2。 表2 肠道组织学炎症评分比较注：与治疗前比较，*P<0.05；益生菌组与SASP组比较，△P>0.05
3.4 细胞因子的表达 见表3。同时我们对试验组和对照组中的缓解组治疗前后的促炎性细胞因子表达进行分析。从表3我们发现两个缓解组促炎性细胞因子的表达在治疗前后差异均有显著性，亦即经过治疗两组肠黏膜的促炎性细胞因子的表达均显著下降。试验组与对照组的缓解组中促炎性细胞因子的表达差异无统计学意义。表3 两组治疗前后细胞因子的表达注：与治疗前比较，*P<0.01；试验组与对照组比较，△P>0.05
4 讨论
非特异性炎症性肠病（溃疡性结肠炎和克罗恩病，IBD）近年来在我国的发病率有逐渐上升的趋势［1］。迄今其病因及发病机制尚未完全明确。最近，一种有关微生物促进IBD发生的观点正日益为人们所接受，即IBD可能由针对自身正常肠道菌丛的异常免疫反应引起的。有两种证据支持这种观点，第一种来自IBD的动物模型，大多数动物在无菌环境中不会发生结肠炎；第二种来自一系列实验，这些实验证实IBD患者针对细菌抗原的细胞和体液免疫反应增强，细菌滞留有利于IBD发生而粪便转流能防止IBD复发，以及抗生素和益生菌对一些IBD患者有益［4］。Kruis等［5］最新研究证实益生菌在溃疡性结肠炎缓解期的维持治疗与美沙拉嗪同样有效。Borody等［6］将益生菌注入6个溃疡性结肠炎患者肠腔并保留5天以图恢复正常菌群，而无其他合并治疗，结果发现在4个月内一直处于症状完全缓解期。我们此次的研究发现培菲康对轻度溃疡性结肠炎的治疗与SASP具有相同的临床疗效，肠道组织学评分亦显示培菲康与SASP具有相同的治疗效果。
肠道是人体内最大的免疫器官和“细菌库”，是机体防御外来抗原和致病微生物侵犯的主要防线。一旦肠黏膜屏障受到损害，肠黏膜通透性增加，肠道内的抗原物质特别是肠菌抗原及其产物被肠黏膜固有膜内的抗原呈递细胞如树突状细胞所摄取，活化的抗原呈递细胞分泌大量的细胞因子诱导、活化并分化T细胞从而激发肠道炎症的级联反应。淋巴细胞及巨噬细胞等在局部肠道聚集并释放各种促炎性细胞因子如IL-1、IL-6和TNF-α等，促进炎症的进一步发展，持续的抗原刺激将导致炎症趋于慢性化。已有大量研究发现在溃疡性结肠炎肠道上述促炎性细胞因子表达均明显升高，而且大多数与疾病的活动呈正相关［7，8］。大量的炎症性肠病动物模型研究显示益生菌治疗可降低促炎性细胞因子分泌［9］。在我们的研究中发现SASP或益生菌治疗缓解组的肠黏膜促炎性细胞因子表达均较治疗前显著下降，并且益生菌组与SASP组之间差异无统计学意义，也提示我们益生菌对轻度溃疡性结肠炎的治疗作用与SASP是等同的。
益生菌是指一类能补充活的有益菌的制剂，如培菲康，大量研究发现益生菌是肠黏膜屏障的保护因子。肠黏膜屏障包括机械屏障、生物屏障和免疫屏障。Gauffin等［10］的动物实验发现可用乳酸杆菌制剂逆转营养不良导致的肠屏障和黏膜免疫功能损害。益生菌可定植在肠道，可干扰病原菌对肠道的黏附和入侵，改变肠微生态促进肠生物屏障功能。还可通过肠sIgA的作用提高肠免疫屏障功能和减轻肠炎症反应以保护肠黏膜屏障功能［11］。但我们目前尚不能确定益生菌对溃疡性结肠炎的治疗作用通过改变肠道菌丛，或者改善肠黏膜的屏障功能抑或存在其他的机制，例如诱导免疫耐受等；以及促炎性细胞因子减少是培菲康的直接作用还是继发于肠黏膜屏障的恢复，又或者益生菌自身可分泌免疫调节因子。我们将在以后的动物模型研究中进一步研究培菲康治疗炎症性肠病的作用机制。
【参考文献】
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8 丁伟群，林庚金，徐三荣，等.溃疡性结肠炎发病中白介素水平的变化.复旦学报，2001，28(4)：330-333.
9 Iris D，Daniel R.Probiotics in inflammatory bowel disease：possible mechanisms of action.Curr Opin Gastroenterol，2005，21：426-430.
10 Gauffin CP，Aguero G，Perdigon G.Adjuvant effects of Lactobacillus casei added in a renutrition diet in a malnourished mouse model.Biocell，2002，26(1)：35-48.
11 Isolauri E，Sutas Y，Kankaanpaa P，et al.Probiotics：effects on immunity.Am J Clin Nutr，2001，73(2S)：444-450.
作者单位： 200040 上海，复旦大学附属华山医院消化科
(编辑：张 彦)