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【摘要】 目的 构建膀胱移行癌7q31.1区域内的杂合性缺失精细图谱，为进一步寻找膀胱移行癌相关基因提供依据。方法 采用显微切割的方法获取较纯的肿瘤组织，选用7个微卫星标志结合PCR技术对 30例膀胱移行癌进行杂合性缺失分析。结果 30例膀胱移行癌组织中，至少有一个位点出现杂合性缺失者 21例，占70%(21/30)；D7S2459、D7S523、D7S2502、D7S486、D7S480、D7S650、D7S2486各位点杂合性缺失频率分别为10.0%、6.7%、23.3%、43.3%、26.7%、26.7%、20.0%；缺失图谱分析显示部分膀胱移行癌常见最小缺失区域位于D7S2502-D7S480之间。结论 膀胱移行癌染色体7q31.1区域发生高频率杂合性缺失，提示该区域可能存在与膀胱移行癌发生有关的抑癌基因。
【关键词】 膀胱移行癌；染色体7q31.1区域；抑癌基因
Study of loss of heterozygosity at chromosome 7q31.1 in transitional cell carcinoma of urinary bladder
ZHANG Feng-hua，LIAO Kun，SONG Xing-zhi.Clinical Medical School，Xiangna College，Chenzhou 423000，China
【Abstract】 Objective To construct a detailed mapping of the chromosome 7Q31.1 deleted region in transitional cell carcinoma(TCC)by polymerase chain reaction-loss of heterozygosity (PCR-LOH)analysis for the further research of TCC-related gene(s).Methods Relatively pure tumor tissues were obtained by microdissection.PCR was used to perform LOH analysis of TCC samples using D7S2459，D7S523，D7S2502，D7S486，D7S480，D7S650 and D7S2486 as primers，which span the 7q31.1.Results Frequency of LOH on chromosome 7q31.1 in TCC tissues achieves 70%(21/30)；seven microsatellite markers frequencies of LOH are D7S2459 10.0%，D7S523 6.7%，D7S2502 23.3%，D7S486 43.3%，D7S480 26.7%，D7S650 26.7% and D7S2486 20.0% respectively.Conclusion The high frequency of loss of heterozygosity at 7q31.1 in TCC implies that there may be some tumor suppressor gene(s) involved in TCC tumorigenesis.
【Key words】 transitional cell carcinoma of urinary bladder；chromosome 7q31.1 region；carcinoma suppressor gene
膀胱癌是最常见的人类泌尿系统恶性肿瘤，主要组织类型为移行细胞癌(transitional cell carcinoma，TCC)，其发病机理尚未阐明。
近年来，7q LOH越来越受到研究者的关注，结果发现7q31.1区域LOH在多种人类肿瘤，如卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌等中频繁出现［1～3］，这提示该区域存在多个与人类肿瘤发生、发展相关的抑癌基因。基于目前还没有在染色体7q31.1区域定位克隆出与移行细胞癌相关的抑癌基因，故对移行细胞癌染色体7q31.1区域等位基因缺失的情况需作进一步深入研究。
1 材料与方法
1.1 材料 30例标本来源于中山医科大学肿瘤医院泌尿外科手术新鲜标本，全部病例均未经治疗，病理诊断均为膀胱移行细胞癌(Ⅰ～Ⅲ级)。正常对照组来自同一患者的癌旁正常膀胱黏膜组织。7对微卫星引物(D7S2459、D7S523、D7S2502、D7S486、D7S480、D7S650、D7S2486)均由上海生工合成。
1.2 方法
1.2.1 显微切割 膀胱移行癌组织经常规处理后做连续病理切片 6～10张，HE染色后于光学显微镜下观察，用针挑出切片上的肿瘤组织置于裂解液中。
1.2.2 DNA抽提 切割出的肿瘤及正常对照组织悬浮在50μl DNA裂解液(50mmol／L Tris—HCl，1mmol／L EDTA，0.1％ Tween 20，200μg／ml 蛋白酶K，pH=8．0)中，50℃消化过夜，得到DNA裂解液，而后95℃变性灭活蛋白酶K，取1～0.5μl进行PCR作杂合性缺失分析。
1.2.3 微卫星序列分析 我们选择7q31.1区域的7对微卫星引物进行分析，PCR反应体系：500～800ng基因组DNA，10pmol引物，0.2mmol dNTP．1×bufer．2U Tag酶，加水至总体积为25μl，PCR反应：95℃变性5min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，循环35次；72℃延长7min。8％聚丙烯酰胺凝胶电泳，15mA，10h后0.2％硝酸银染色，摄片观察肿瘤的电泳带比正常对照减少超过50％以上的被认为是发生缺失，肿瘤的两条带均发生缺失的称纯合性缺失，肿瘤的两条带只缺失一条的称杂合性缺失。
2 结果
30例膀胱移行癌病例中有21例至少1个位点存在等位基因的缺失(70.0%)。各位点的等位基因缺失频率分别为：D7S2459 10.0%(3/30)，D7S523 6.7%(2/30)，D7S2502 23.3%(7/30)，D7S486 43.3%(13/30)，D7S480 26.7%(8/30)，D7S650 26.7%(8/30)，D7S2486 20.0%(6/30)，其中缺失频率最高的微卫星位点是D7S486(图1、表1)。 表1 膀胱移行癌组织中7q31.1区域7个
21例LOH中，11例表现为连续性片段缺失，其中病例3在检测的7个位点中有6个位点存在缺失。病例3、8、19、22、29在D7S2502和D7S486两个相邻位点同时存在LOH，说明这两个位点为这些病例的共同缺失区域。病例3、7、10、13、22、27在D7S486和D7S480两个相邻位点同时存在缺失，表明这两个位点则是这些病例的共同缺失区域。值得注意的是，病例3、22在位点D7S2502、D7S486和D7S480三个相邻的位点均表现为连续性片段缺失(图2)。根据这3个位点都具有较高频率的等位基因缺失，推测膀胱移行癌染色体7q31.1区域附近常见最小缺失区域位于D7S2502-D7S480之间，大约3.4cM遗传距离。
3 讨论
肿瘤抑制基因及DNA损伤修复基因的失活与癌基因的激活奠定了肿瘤发生发展的分子基础，染色体的杂合性缺失分析为定位克隆肿瘤抑制基因及DNA 损伤修复基因提供了便利。膀胱肿瘤LOH 的研究，过去常用 Southern 杂交、RFLP、VNTR 等方法，目前，多用微卫星分析法，该方法较以前方法有许多优点，即容易筛选、种类多、分布广、高度多态性、重组率低、在人群中表现高度特异性、并且按孟德尔共显性方式遗传，可更快更精确地进行较大数目的连锁分析。此外，MS分析仅用几纳克(ng)模板DNA就可以完成实验，而Southern杂交则需数毫克，因而我们选用了微卫星分析TCC杂合性缺失。
膀胱肿瘤染色体 1p、 3p、4p、8p、 9p、9q、10q、 11p、13q、17p、17q 有LOH 存在，然而尚未发现7q区域存在LOH［4～8］。以往在染色体7q31.1区域微卫星位点等位基因缺失的研究中，发现许多肿瘤存在杂合性缺失。Zenklusen JC［9］、 Wang XL［10］等研究发现头颈癌、结肠癌、前列腺癌、口腔癌在7q31.1均有频发的等位基因缺失，且通过分析缺失图谱认为其缺失区域多位于D7S522。由于微卫星位点D7S522在一系列人类恶性肿瘤中，如头颈鳞癌、前列腺癌、肾细胞癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌等，均出现频发的等位基因缺失，许多学者认为该位点可能至少存在一个与多种人类恶性肿瘤相关的TSG。caveolins -1和-2基因定位于染色体7q31.1-q31.2区域，caveolin基因的微卫星位点分析显示该基因包含了位点D7S522，但并未检测到包含其他微卫星位点，由于 caveolin-1基因已被证实有转化抑制活性［11～13］，所以他们认为 caveolin-1是染色体7q31.1区域位于位点D7S522的TSG。
在本研究中，分析了30例膀胱移行癌在7q31.1区域的等位基因缺失情况，发现至少有一个位点有LOH的占70%，常见最小缺失区域位于D7S2502-D7S480之间，该区域虽然包含了位点D7S522，但在本实验结果中膀胱移行癌组织LOH频率最高的位点是D7S486 (43.3%，13/30)，而不是“热点位点”D7S522。经分析，本研究认为染色体7q31.1区域还存在一个与膀胱移行癌密切相关的TSG，定位于位点D7S486，它与位于位点D7S522的肿瘤抑制基因caveolin-1可能不是同一基因。多种人类恶性肿瘤染色体7q31.1区域LOH的研究表明最小常见缺失区域集中在MET基因—D7S486之间1000kb内，而位点D7S522位于该区域的正中间，即D7S486下游500kb和MET基因上游500kb处。已知包含细菌人工染色体基因克隆的caveolin的平均插入片段大小为～80-100kb，故caveolin-1和-2基因很可能定位于D7S522上游或下游～100kb范围内，即最大范围为～200kb，那么在位点D7S486完全有可能存在一个与膀胱移行癌密切相关的TSG，该TSG与caveolin-1可能是位于染色体7q31.1区域的，分别与不同恶性肿瘤相关的两个TSG。这个结论与Zenklusen JC［14］的研究结果相符，认为染色体7q31.1区域存在第二常见的阿非迪霉素诱导的脆性位点Fra7G，定位于该位点的基因就是与多种上皮来源的肿瘤相关的TSG，其最小共同缺失区域大约1.5Mb大小，并且界定于微卫星位点 D7S486 和D7S655之间，所以本研究有理由推测位点D7S486上存在一个与膀胱移行癌相关的TSG。
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作者单位：423000 湖南郴州，湘南学院临床医学系
(编辑：守 中)