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【摘要】 目的 通过肾阳虚模型血浆内皮素、一氧化氮含量的变化，而探索“阳虚则寒”寒证的分子机制，以进一步明确肾阳虚证的物质基础。方法 用腺嘌呤灌胃复制小鼠肾阳虚模型，通过硝酸还原酶法和放射免疫法分别检测血浆一氧化氮(NO)和内皮素(ET)的含量，并用SPSS12.0软件统计分析。结果 肾阳虚组血浆内皮素含量高于正常对照组 (P＜0.05), 一氧化氮低于正常对照组，但两组比较无统计学意义（P＞0.05）。结论 肾阳虚时机体血浆ET水平升高而导致的分别以ET、NO为主的缩血管与舒张血管因素动态平衡失调为“阳虚则寒”寒证的分子机制之一。
【关键词】 肾阳虚; 阳虚则寒; 一氧化氮; 内皮素
The molecular mechanism study on the cold syndrome of the yang asthenia causing cold theory--changes of ET and NO in plasma of the mice with renal yang asthenia syndrome
LIU Xin, LAN Jin Mei, LI Dong Mei, et al. Guizhou Zunyi School of Traditional Chinese Medicine，Zunyi 563004, China
【Abstract】 Objective To explore the molecular mechanism of the cold syndrome of the yang asthenia causing cold，for finding out furtherly the material basis of renal yang asthenia syndrome by changs of ET and NO levels in plasm of the mouse models with renal yang asthenia syndrome. Methods To establish the mouse model of renal yang asthenia syndrome by perfusing the stomach with adenine 30mg/100g.body weight.d continuously for 30 days and detect the ET and NO levels in plasma on the last day, and then,process these data by SPSS 12.0. Results Levels of ET were significantly higher in plasma of the renal yang asthenia mice than those of the nomal-control and levels of NO were lower but insignificantly.Conclusion It is the one of the cold-syndrome molecular mechanism of the yang asthenia causing cold theory that cause the dynamic imbalance of vasoconstrictor and vasodilator factors respectively represented by levels of ET and NO in blood due to ET overexpression in renal yang asthenia syndrome.
【Key words】 renal yang asthenia; yang asthenia causing cold;nitrous oxide;endothelin(ET)
“阳虚则寒”为阳虚失其温煦，阴寒内盛所致［1］，据目前研究认为，肾阳虚主要是下丘脑—垂体—靶腺轴（肾上腺、甲状腺、性腺、胸腺轴）功能减退所致，并认为主要与肾上腺轴功能不足致肾上腺皮质激素分泌不足有关［2～6］;但这还不能足以解释虚寒证的机制。此外，机体能量代谢平衡的维持，与皮肤血管的功能状态密切相关，而血浆内皮素(ET)和一氧化氮(NO)为维持正常外周及皮肤血管功能状态的两个主要因素［11，14］，关于肾阳虚与内皮素和一氧化氮的关系目前还未见报道。
1 材料与方法
1.1 实验材料 (1)动物：二级(清洁级)KM小鼠45只，体重18～22g，雌雄各半，由贵阳医学院实验动物中心提供。(2)仪器：γ放射免疫计数仪（Gｃｒ－2010）为中国科大中佳光电仪器公司产品,722型光栅分光光度计（由山东高密分析仪器厂生产）,电子恒温水浴锅（由天津市泰斯特仪器有限公司生产）, 80-2型台式离心机（由上海手术器械厂生产）,电子分析天平（BS110S，由德国赛多利斯股份公司生产）,病理图文分析系统(PITS2000，由重庆天海公司生产)。(3)药物及制剂：腺嘌呤（批号82642255，由北京欣经科生物技术有限公司生产），一氧化氮检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），内皮素、皮质醇检测试剂盒（北京科美东雅生物技术有限公司）。(4)金匮肾气丸：（批号031002，由河南省宛西制药股份有限公司生产）。
1.2 方法
1．2.1 动物模型制备及分组［13］ KM小鼠45只，随机分成3组（正常对照组、肾阳虚组、药物干预组），每组15只。用腺嘌呤按30mg/100ｇ体重给小鼠灌胃，每日1次，连续30天，以复制肾阳虚小鼠模型，正常对照组用生理盐水灌胃，药物干预组于第20日始与金匮肾气丸按375mg/14.5ｍｌ灌胃，每日1次，连续10天；所有小鼠于第30日从摘眼球取血约1ｍｌ，放入含10%的EDTA二钠15μl和抑肽酶20μl的试管中，混匀于3500ｒ／ｍｉｎ，离心15min，取上清液于EP管中置－20℃冰箱保存，以检测NO、ET及皮质醇（Cor）含量。采血后取动物肾脏与睾丸组织，置于10%的甲醛中固定24ｈ，然后脱水、透明、浸蜡、包埋及切片，进行病理学观察。
1.2.2 肾阳虚模型的评价方法 据文献从一般情况、病理学改变、血浆皮质醇水平等鉴定肾阳虚模型［13，15，16］。
1.3 检测指标及方法
1.3.1 ＮＯ检测 ＮＯ化学性质活泼，体内代谢转化为硝酸盐(ＮＯ3-)和亚硝酸盐(ＮＯ2-)，血浆(ＮＯ3-)与(ＮＯ2-)浓度之和(ＮＯ3-+ＮＯ2-)才能准确代表体内(ＮＯ)水平。测定血浆(ＮＯ3-+ＮＯ2-)含量，我们采用了硝酸还原酶法，严格按照试剂盒使用说明书所规定的操作规程和结果判定方法进行。
1.3.2 内皮素、皮质醇的检测 内皮素、皮质醇测定采用放射免疫法，严格按照试剂盒使用说明书操作步骤进行。
1.4 统计学方法 所有数据用均数±标准差（x±s）表示，各组间比较采用SPSS12.0统计软件进行统计分析及t检验，P＜0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 一般情况观察 肾阳虚小鼠出现消瘦、多尿、体毛干枯不齐、稀疏、脱落现象及蜷缩拱背、反应迟钝、少动闭眼及唇、尾部苍白；治疗组小鼠以上表现均较模型组轻。肾阳虚组肾脏肉眼观察体积增大，颜色苍白，或肾色苍黄，浊肿，表面呈颗粒状，切面见肾皮质色淡，呈缺血状，皮、髓质分界模糊。
2.2 肾与睾丸组织的病理学变化 肾阳虚组肾小球毛细血管球细胞数量减少，部分肾小球萎缩，局部见硬化及玻璃样变；部分肾小管管腔扩张，部分萎缩，管腔内随处可见胶样管型，部分管腔内可见棕黄色针状结晶，放射状排列呈环状，少量肾小管内见细胞管型；间质纤维组织增生，血管周围尤为明显，见大量淋巴细胞浸润，局部区域见坏死及中性白细胞浸润。药物干预组肾脏组织学改变较肾阳虚组轻，胶样管型肾小管减少，细胞管型增多。肾阳虚组睾丸部分曲细精管管腔退化变性，腔内各级生精细胞排列紊乱，细胞减少、变薄，精子产生减少或缺如，曲细精管间纤维结缔组织轻度增多，局部玻璃样变，间质细胞数量减少。药物干预组睾丸萎缩状况较肾阳虚组轻，但不如正常组良好。见图1～６。
2.3 内皮素含量 肾阳虚组血浆内皮素含量较正常对照组高（二者比较P＜0.05），但与药物干预组比较其差异无显著性（P＞0.05），药物干预组与正常对照组比较其差异也无显著性（P＞0.05）。见表1。
2.4 皮质醇含量 肾阳虚组血浆皮质醇含量较正常对照组低（P＜0.05），也较药物干预组低（P＜0.05），药物干预组与正常对照组比较差异无显著性（P＞0.05）。见表1。
2.5 NO含量 各组15只小鼠所取血浆用于测NO时，有些样本血浆量不够予以剔除，但各组所剩样本数尚达到重复性原则之要求；其结果示肾阳虚组NO含量与正常对照组及药物干预组比较差异皆无显著性（P＞0.05）。详见表1。表1 三组动物血浆中ET、Cor、NO含量的比较注：与正常组比较，P＜0.05，△P＞0.05；与肾阳虚组比较，P＞0.05，△△P＞0.05，P＜0.05
3 讨论
对肾阳虚本质的探讨，30多年来取得了多方面的进展，广泛涉及神经系统、内分泌系统，免疫学和基础代谢等方面。“阳虚则寒”，为阳虚失其温煦，阴寒内盛所致，主要表现为畏寒肢冷，腰膝冷痛，白带清稀，脉沉苔白等［1］，据目前研究认为，肾阳虚主要是下丘脑—垂体—靶腺轴（肾上腺、甲状腺、性腺、胸腺轴）功能减退所致，并认为主要与肾上腺轴功能不足致肾上腺皮质激素分泌不足有关［2～6］。宋春风等研究发现肾阳虚大鼠下丘视交叉上核和肾上腺c-FOS蛋白过度表达；下丘脑，血淋巴细胞Ca2+及血清钙含量明显增加，并认为肾阳虚的发病与Ｃａ2+信号的异常致下丘脑—垂体肾上腺轴功能紊乱，免疫功能低下有关，且补肾中药能通过调整Ｃａ2+信号而发挥治疗作用［7，8］。段元丽、沈自尹等也发现补肾中药能增强肾阳虚大鼠下丘脑去甲肾上腺素神经元的活动［9］。故下丘脑—垂体—靶腺轴功能不足致肾阳虚之机理比较明确，此轴功能不足可影响机体的产热主要是代谢产热而导致能量代谢失衡；据目前西医的研究进展，正常情况下机体能量代谢平衡主要从产热和散热两方面进行自我调控，环境温度20℃～30℃ 时，机体能量代谢最为稳定，环境温度＜20℃或＞30℃机体代谢率皆会增高而产热增加；而机体散热主要通过皮肤传导、对流、辐射及蒸发来实现，前三者散热与皮肤及外周血管扩张密切相关，皮肤及外周血管功能状态又与血中ET、NO的含量关系密切［10～１２，14］。在下丘脑体温调节中枢调定点恒定时，机体产热减少和/或散热增加致体核与体表温度及体表与周围环境的温差增大，以及中枢调定点上移致暂时性体内温差增大，而致产热和散热平衡失调［10，11］，可出现寒证表现；病理性的机体产热减少多由于甲状腺、肾上腺轴功能不全致代谢低下所致，这正是肾阳虚靶腺轴功能不足的表现［2～6］，但这并不能足以解释虚寒证的所有临床表现，况且，并不能完全确定所有虚寒证皆有此轴功能不足，故“阳虚则寒”之寒证还有其他机制；此外，机体散热及与之关系密切的ET、NO与肾阳虚的关系目前还未完全明了。
为了进一步明确肾阳虚之寒证的分子机制和与ET、NO的关系，我们复制了小鼠肾阳虚模型，据肾阳虚小鼠的整体表现、肾与睾丸组织的病理改变及血浆皮质醇含量的变化（与正常对照组比较 P＜0.05)提示肾阳虚模型复制成功。ET为具有21个氨基酸的多肽家族，广泛分布于血管内皮细胞和平滑肌细胞上，目前已发现三个异构体(ET1、ET2、ET3)，其中ET1是迄今所发现的缩血管作用最强的物质，它与其受体结合后，通过激活鸟苷酸环化酶、磷脂酰肌醇系统和电压依赖性L型钙通道，转导信号，而强烈持久地收缩血管平滑肌［11，14］。NO为NO合成酶作用精氨酸而生成，其主要通过激活鸟苷酸环化酶来实现信号转导，产生环一磷酸鸟苷(cGMP)而使血管平滑肌松弛［11，14］。正常情况下，分别以二者为主的缩血管与舒张血管因素相互拮抗，防止了血管的过度收缩与扩张而处于动态平衡，并调控着皮肤的血流量而控制散热［11，14］。据本实验结果所示，肾阳虚时，血浆ET含量高于正常对照组(二者比较，P<0.05)，而NO降低，但与正常对照组比较，无统计学意义(P>0.05)，说明肾阳虚时上述动态平衡失调，以ET为主的缩血管因素占优势，而使皮肤血管收缩，皮肤血流量减少，在机体产热减少的同时，经皮肤散热减少，这也说明肾阳虚时机体的自我调控、代偿反应未完全丧失，产热减少而散热也相应减少，这正是机体为保存体温而产生的保护性代偿反应；当然，病情进一步加重如达亡阳证阶段，此代偿反应可能会丧失。
由于外周及皮肤血管收缩，舌质微循环血量减少，故脉沉苔白；产热、散热皆减少，与环境温差增大，体表微循环血流迟缓，故畏寒、肢冷、腰膝冷痛；由于性腺轴功能减退，雌孕激素分泌失调，加上糖皮质激素降低，而使子宫、阴道上皮增生减低，腺体分泌紊乱，使分泌物中细胞成分、蛋白成分减少，故白带清稀。本实验金匮肾气丸组小鼠肾阳虚表现、肾及睾丸病理改变较轻，血皮质醇不低，提示温阳治疗有效，但对ET、NO无明显影响，可能是金匮肾气丸的温阳作用，通过多环节、多位点调控相关基因的表达，到相关蛋白质的改变，需一个过程，由于疗程未足，所以对NO、内皮素影响不明显。
4 结论
肾阳虚时机体血浆ET水平升高而导致的分别以ET、NO为主的缩血管与舒张血管因素动态平衡失调为“阳虚则寒”寒证的分子机制之一。
(本文图片见封三)
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作者单位：1 563004 贵州遵义，贵州遵义中医学校
2 563000 贵州遵义，遵义市妇女儿童医院病理科
(编辑：守 中)