点击显示 收起
【摘要】 目的 通过体外培养的方法，建立原代心肌细胞柯萨奇病毒感染性病毒性心肌炎模型，用中药虎杖苷（PD）处理该疾病模型，观察对该疾病的干预作用。方法 体外培养心肌细胞，用100 TCID50柯萨奇B3病毒（CVB3）感染心肌细胞，建立病毒性心肌炎实验模型，然后分别用0.02mmol/L、0.2mmol/L、2mmol/L三种不同浓度的PD处理感染CVB3病毒的心肌细胞，观察心肌细胞的形态和搏动，用细胞免疫荧光技术标记纤维状肌动蛋白（F-actin）和VEGF蛋白，四唑蓝比色法（MTT Assay）测定心肌细胞活性和病毒抑制率，流式细胞仪检测各组心肌细胞VEGF蛋白和F-actin平均荧光强度。结果 0.02mmol/L和0.2 mmol/L PD对心肌细胞无毒性作用。2 mmol/L PD对心肌细胞有一定毒性作用；病毒对照组细胞病变明显，0.02 mmol/L和0.2 mmol/L PD处理组均呈现明显的抗病毒作用；免疫荧光显微镜下观察，病毒对照组心肌细胞骨架破坏、VEGF蛋白解聚、重构；0.02 mmol/L和0.2 mmol/L PD处理后F-actin和VEGF蛋白分布均有所恢复；流式细胞仪测得各浓度PD处理组F-actin和VEGF蛋白表达量均明显高于病毒对照组（P＜0.05）。结论 柯萨奇B3病毒对新生大鼠原代心肌细胞有直接损伤性作用，并可导致心肌细胞F-actin骨架蛋白解聚和弥散性分布，影响心肌收缩力；PD可以明显抑制柯萨奇B3病毒对新生大鼠原代心肌细胞的致病变效应，维持心肌细胞骨架正常形态和功能，尤以0.2mmol/L浓度的PD效果最佳。
【关键词】 虎杖苷；柯萨奇B3病毒；心肌细胞；纤维状肌动蛋白；细胞骨架
Antiviral effect of polydatin in vivo on viral myocarditis
SONG Jun-hua,WANG Shu-yun,MOU Dao-yu,et al.Qingdao Healthy School,Qingdao 266071,China
【Abstract】 Objective To study the antiviral and protective effect of polydatin (PD) on the cultured rat neonatal cardiomyocytes of viral myocarditis (VMC) induced by coxsackievirus B3 (CVB3).Methods Primary cultures of Sprague-Dawley (SD) rat neonatal cardiac myocytes were prepared and inoculated with 100 TCID50 CVB3 as experimental model of viral myocarditis. Different concentration of PD was added into cardiomyocytes infected by CVB3. The cardiomyocyte viability were detected by MTT assay for calculating the survival rate and the inhibitory rate of the virus. Myocardial F-actin and VEGF were analyzed by immunofluorescent staining with confocal microscopy. Mean fluorescent intensity of F-actin and VEGF were determined by flow cytometry.Results There is no toxicity on cardiomyocytes when PD is at concentration of 0.02 mmol/L and 0.2 mmol/L while there is toxicity at concentration of 2 mmol/L. CVB3 could reduce the viability of cardiomyocytes, depolymerize F-actin cytoskeleton and reorganize VEGF protein. Different concentration of PD could effectively lessen the occurrence of cytopathic effect and increase the survival rate of CVB3 infected cardiomyocytes significantly. PD could also inhibit the replication of CVB3 and attenuate the CVB3-induced changes of myocardial cytoskeleton and VEGF organization, especially at dose of 0.2 mmol/L. The results of flow cytometry showed the expression of F-actin and VEGF were significantly increased in PD treated group compared with viral control group and the level of VEGF was increased in dose-dependent manner.Conclusion CVB3 could cause damage of rat neonatal cardiomyocytes directly, induce F-actin cytoskeleton depolymerization and VEGF protein reorganization and then decline the contractility of cardiac myocytes;PD could effectively lessen the occurrence of cytopathic effect induced by CVB3 and maintain normal morphology and function of cardiomyocytes, especially at a dose of 0.2mmol/L.
【Key words】 polydatin; CVB3；cardiac myocytes; F-actin; cytoskeleton
病毒性心肌炎是临床常见的心脏疾患，近几年来发病率有增高的趋势，柯萨奇B3病毒感染在本病中占重要地位，但目前西医缺乏对本病的有效治疗药物。近年中药虎杖苷（PD）在防治冠心病方面取得了明显的效果，是近年来研究较多的一类植物抗毒素，其心血管保护作用也逐渐成为研究热点。曾有报道PD具有抗柯萨奇B3病毒的作用。本实验通过体外细胞培养的方法检测正常和病理状态下心肌细胞骨架F-actin和VEGF的分布及表达，从而观察PD对病毒性心肌炎的作用效果，为病毒性心肌炎的治疗开拓新的领域。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 出生1～3天 Sprague-Dawley（SD）乳鼠，清洁级，雌雄不限，第一军医大学实验动物中心提供。
1.1.2 病毒 CVB3病毒Nancy株由山东省医学科学院病毒所提供，经Hela细胞培养扩增后，病毒滴度为106 TCID50/ml，小量分装后-80℃保存备用。
1.1.3 试剂 罗丹明-鬼笔环肽荧光探针（Rhodamine-Phalloidin）（Molecular Probes，美国）；5mg/ml MTT（Sigma公司）；rabbit anti-VEGF（Neuwork，美国）；goat-anti-rabbit-FITC IgG（Zymed，美国）；PD（40 mg/支，批号20021129，深圳海王天然药物室；第一军医大学病理生理学教研室友情提供）。
1.1.4 仪器 二氧化碳培养箱（NAPCO5420，美国）；激光扫描共聚焦显微镜（Leica TCS SP2，Leica，德国）；多孔板高效阅读器（HTS 7000，日本）；流式细胞仪（Coutler，美国）。
1.2 方法
1.2.1 心肌细胞原代培养 参照常规方法［1］。取出生1～3天SD大鼠乳鼠，75%酒精消毒皮肤，无菌取出心脏，置于青霉素小瓶中，用PBS洗去血液，剪去心外膜及相连筋膜后用眼科剪剪至1mm3左右。加入0.06%胰蛋白酶37℃ 消化7～8次，每次消化时间不超过10min。弃去前2次消化的上清液，收集第3次及以后的上清液，加胎牛血清终止消化。最后离心1000rpm×8min，离心后的沉淀用含20%胎牛血清的DMEM培养基轻轻吹打制备细胞悬液。将所得细胞悬液接种到培养瓶中，置5% CO2 37℃培养箱培养90min后轻轻吸出细胞上清，接种到培养瓶、96孔板或微孔小皿（petri dishes）中继续培养，48h换液1次。
1.2.2 PD对正常大鼠心肌细胞的毒性作用实验 96孔板中每孔加入5×104的乳鼠心肌细胞，培养48h，细胞长成单层后，显微镜下可见心肌细胞搏动有力，多数细胞能够同步向心性收缩，搏动次数平均80次/min左右。加入终浓度分别为0.02mmol/L、0.2mmol/L、2mmol/L的PD，每种浓度重复8孔，并设正常细胞对照。置5% CO2 37℃培养箱继续培养48h，用MTT法测各孔在570nm波长下的吸光度（absorbency，A）值。
细胞存活率（%）=（药物组平均A值/对照组平均A值）×100%
1.2.3 PD对CVB3病毒增殖的抑制作用 96孔板中每孔加入5×104的乳鼠心肌细胞，培养48h，细胞长成单层后，每孔接种100 TCID50的CVB3病毒液，于37℃吸附60min后，弃病毒上清。加入终浓度分别为0.02mmol/L、0.2mmol/L、2mmol/L的PD，每种浓度重复8孔，并设正常细胞对照组和病毒对照组。置5% CO2 37℃培养箱继续培养48h，用MTT法测各孔在570nm波长下的A值。并按下述公式计算药物对CVB3病毒的抑制率。
病毒抑制率（％）=（药物处理组平均A值－病毒对照组平均A值）/（正常对照组平均A值－病毒对照组平均A值）×100%
1.2.4 免疫荧光标记 (1)PBS冲洗心肌细胞5min×3次；(2)3.7%多聚甲醛固定和0.3% Triton X-100在细胞膜处打孔20min；(3)PBS冲洗心肌细胞5min×3次；(4)10%小牛血清的PBS孵育60min对一抗进行非特异性封闭；(5)加入一抗： rabbit anti-VEGF室温孵育60min；(6)PBS冲洗心肌细胞5min×3次；(7)10%小牛血清的PBS孵育60min对二抗进行非特异性封闭；(8)冷PBS漂洗2min×3 次；(9)加入荧光二抗goat-anti- rabbit -FITC IgG和罗丹明-鬼笔环肽2 U/ml避光室温孵育60min；(10)PBS冲洗心肌细胞5min×3次；然后用Nikon TE 300倒置荧光显微镜观察，Kodak 400胶卷拍照或应用激光扫描共聚焦显微镜观测。
1.2.5 MTT细胞活力的评定 96孔板每孔加入5mg/ml的MTT 20μl，37℃孵育4h后，尽量吸去培养液，每孔加150μl二甲基亚砜，震荡10min至形成的结晶完全溶解，用酶联检测仪测定570nm波长下的A值。
1.2.6 流式细胞仪检测免疫荧光强度 (1)离心收获细胞，1000rpm×10min，弃上清，加入PBS冲洗心肌细胞5min×3次；(2)固定、穿膜处理：3.7%多聚甲醛固定、0.3% Triton X-100打孔20min。(3)离心收获细胞，1000rpm×10min，弃上清，加入PBS冲洗心肌细胞5min×3次；(4)封闭：加入适当体积的小牛血清，室温封闭30min。(5)细胞染色：加入VEGF一抗孵育60min后，冲洗心肌细胞，再加入荧光二抗和罗丹明-鬼笔环肽4℃过夜进行免疫荧光标记。(6)离心收获细胞，1000rpm×10min，弃上清，加入PBS冲洗心肌细胞5min×3次；(7)调细胞浓度为1×105/ml。(8)流式细胞仪检测。
1.2.7 统计学方法 本实验数据采用均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS12.0软件进行统计学分析，P＜0.05差异有显著性。
2 结果
2.1 PD对大鼠心肌细胞的毒性作用 用不同浓度的PD直接作用于心肌细胞，培养48h，发现2mmol/L PD对心肌细胞有一定的毒性作用，表现为部分细胞出现圆缩、壁厚、粘连、脱落，且可聚集成条索状，少量细胞搏动停止，立体感消失，折光感增强，存活的细胞数减少，MTT测得的A值也相应减小，明显低于正常对照（P＜0.05），细胞存活率明显降低，为62.0%。0.02mmol/L和0.2mmol/L PD对心肌细胞无明显毒性作用，还可使正常心肌细胞收缩加快，搏动增强，其细胞存活率分别为101.1%和103.1%。
2.2 PD抑制CVB3病毒的作用 病毒对照组细胞病变明显，心肌细胞自律性搏动减慢、幅度减小，3～60次/min，表现为细胞皱缩、变圆、脱落、碎裂、胞浆内颗粒增多，细胞数量明显减少，体积缩小，零散的细胞之间出现片状的空白区，细胞存活率仅为24.8%。各浓度PD处理组细胞病变明显减轻，均有较明显的抗病毒作用，根据MTT所测吸光度A值计算出0.02 mmol/L、0.2mmol/L和2mmol/L PD处理组的病毒抑制率分别为41.3%、80.2%和61.4%，心肌细胞搏动增强。0.2mmol/L PD抑制CVB3病毒增殖的效果最好。
2.3 不同浓度PD对正常心肌细胞骨架和VEGF的影响 免疫荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜下观察，正常心肌细胞F-actin呈细丝状，纤维平行规则排列，粗细匀称，集中于心肌细胞靠近细胞膜处，细胞核部位没有荧光染色，呈“空洞”状。细胞边缘清晰，细胞形态完整；VEGF蛋白在正常心肌细胞中也有表达，主要分布在胞浆内近胞核处。0.02mmol/L和0.2mmol/L PD对正常心肌细胞骨架和VEGF分布无明显影响，结构类似于正常心肌细胞，见图1。
流式细胞仪测定心肌细胞F-actin和VEGF平均荧光强度（mean fluorescent intensity, MFI），结果显示， 0.02 mmol/L和0.2 mmol/L PD对正常心肌细胞F-actin和VEGF蛋白表达无明显影响（P＞0.05)，见表1。表1 正常心肌细胞经不同浓度PD处理后F-actin、VEGF蛋白平均荧光强度注：P＞0.05 vs normal control
2.4 不同浓度PD对CVB3感染心肌细胞骨架和VEGF的影响 病毒对照组心肌细胞F-actin胞膜处染色荧光强度变弱甚至消失，细胞浆内F-actin方向错乱不规则甚至是断裂，胞核处也有散在F-actin纤维分布，细胞轮廓模糊；VEGF蛋白分布松散，数量明显减少。说明CVB3对心肌细胞有较强的毒害作用，可以引起心肌细胞内F-actin和VEGF表达减少及重新分布（图2）。
经小剂量（0.02 mmol/L）虎杖处理CVB3感染的心肌细胞，可见F-actin微丝束明显增多，特别是细胞核周围明显增多，但排列仍有些紊乱；VEGF分布也有所好转（图2）。
经中剂量（0.2 mmol/L）PD处理的感染心肌细胞，F-actin分布规则，染色深而清晰，集中于心肌细胞靠近细胞膜处，排列有序性增强；VEGF分布也明显改善，主要分布在胞浆内近胞核处，形态与正常心肌细胞相似（图2）。
流式细胞仪检测CVB3感染心肌细胞F-actin和VEGF平均荧光强度，结果显示两种蛋白表达量均显著减少（P＜0.05），经不同浓度PD处理后F-actin和VEGF表达均明显增加（P＜0.05）。各组心肌细胞F-actin和VEGF平均荧光强度见表2。表2 CVB3感染心肌细胞经不同浓度PD处理后F-actin、 VEGF蛋白平均荧光强度 注：*P＜0.05 vs viral control
3 讨论
PD可以增强心肌细胞的收缩力，还具有较强的抗病毒作用［2～4］，对多种病毒如人类单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒等都有抑制作用，但关于PD在细胞水平上抗柯萨奇B3病毒的研究，目前报道极少，仅发现一篇应用生药虎杖提取液的相关研究［5］。
心肌细胞F-actin直接参与细胞的运动和收缩。F-actin与跨膜分子相连，是跨膜力传递的主 要环节，介导受体的信号转导。在外界环境刺激和剪切力作用下，细胞通过多种信号转导的途径介导肌动蛋白微丝发生重组，甚至致密周围束消失。Hori等人［6, 7］在研究终末期心衰时发现微丝、微管及中间纤维结蛋白支架结构受到破坏，它们排列紊乱，影响肌小节的移动，兴奋－收缩耦联受抑制，导致心肌收缩力的下降。
图1 不同浓度PD处理心肌细胞后F-actin和VEGF共聚焦图像(×1000)图2 不同浓度PD处理CVB3感染心肌细胞后F-actin和VEGF共聚焦图像(×1000)
本实验发现在CVB3感染心肌细胞后，镜下心肌细胞搏动减弱，变为不规则，甚至停止。心肌细胞变圆成堆，细胞皱缩甚至破碎。随感染时间延长，病变范围扩大。提示病毒感染导致了心肌细胞的损伤，胞膜通透性增高，细胞变性坏死。图2表明激光共聚焦显微镜下观察， CVB3刺激后心肌细胞微丝分布的弥散性趋势以及胞浆内平行排列的F-actin消失，提示收缩性肌丝减少甚至消失，细胞骨架裂解，细胞边缘不清晰，整个心肌细胞图像纹理变得模糊，表明细胞骨架对CVB3刺激非常敏感，从而也可说明CVB3感染时心肌细胞搏动无力、缓慢的机制以及解释临床病毒性心肌炎病人出现心音低钝的原因。MTT测得吸光度A值改变和流式细胞仪定量分析也支持上述观点。
用不同浓度（0.02mmol/L，0.2mmol/L）的PD处理CVB3感染心肌细胞，均呈现明显的抗病毒作用，病毒抑制率在41.3%～80.2%之间，与病毒对照组相比，细胞病变明显减轻，细胞活力显著增加，特别是0.2 mmol/L PD效果尤为突出，而2 mmol/L PD对原代心肌细胞有一定的损伤作用。
图2结果说明中、小剂量PD有一定抗CVB3刺激维持细胞骨架作用，中剂量PD效果更好。除激光共聚焦显微镜结果外，流式细胞仪结果也定量地反映了中、小剂量PD可以抵抗CVB3刺激，从而很好地维持心肌细胞的正常形态和功能。
本实验用体外培养心肌细胞的方法，证实了心肌细胞对CVB3刺激非常敏感，导致细胞骨架蛋白出现弥漫性变化。PD能抑制CVB3刺激对心肌细胞F-actin的重排作用，保护心肌细胞的骨架系统，使其维持正常的形态和正常的收缩、运转功能，为PD在治疗病毒性心肌炎方面提供了理论依据。
血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） 在正常机体组织和血浆渗出液中呈低水平、稳定地表达。实际上，在个体胚胎发育过程中就有VEGF的表达，可能与胚胎体内血管形成有关。在成人体内，子宫内膜、黄体和胎盘都有VEGF的高度表达， VEGF参与了正常体内的血管形成过程［8］。此外，在正常成年个体的心脏、脑组织、骨骼肌以及肾脏，都有VEGF不同程度的表达。在这些部位，并没有明显的新生血管形成。据推测VEGF的存在可能与维持这些部位血管的正常功能状态有关。
我们通过对培养的乳鼠心肌细胞中VEGF蛋白的免疫荧光检测发现，VEGF蛋白在正常心肌细胞中有较强表达，主要分布在心肌细胞胞浆靠近细胞核处。CVB3刺激后可使VEGF表达明显减弱，分布弥散，分析原因可能为CVB3可直接导致心肌细胞膜结构不完整，胞核碎裂、心肌细胞溶解破坏，使胞浆内容物外流而致。
CVB3感染心肌细胞经各种浓度的PD处理后，使VEGF蛋白分布呈剂量依赖性改善，表达强度与PD药物浓度呈直线正相关，说明PD具有增强CVB3感染心肌细胞表达VEGF蛋白的作用，从而起到保护和维持心血管系统功能的效应，其确切机制尚有待进一步实验来探讨。
【参考文献】
1 汪长华. 心肌细胞的培养及注意事项. 中国心脏起搏与心电生理杂志，2003，17(3)：230-232.
2 Docherty JJ, Fu MM, Stiffler BS, et al. Resveratrol inhibition of herpes simplex virus replication. Antiviral Res, 1999, 43 (3): 145-155.
3 Kapadia GJ, Azuine MA, Tokuda H,et al. Chemopreventive effect of resveratrol, sesamol, sesame oil and sunflower oil in the Epstein-Barr virus early antigen activation assay and the mouse skin two-stage carcinogenesis. Pharmacol Res, 2002, 45(6):499-505.
4 Evers DL, Wang X, Huong SM, et al. 3,4’x,5 - Trihydroxy - trans -stilbene (resveratrol) inhibits human cytomegalovirus replication and virus-induced cellular signaling. Antiviral Res, 2004, 63(2): 85-95.
5 王卫华，肖红，陈科力，等. 虎杖提取液抗柯萨奇病毒B3的实验研究. 湖北中医杂志，2001，23(9): 47-48.
6 Tsutsui H, Tagawa H, Kent RL. Role of microtubules in contractile dysfunction of hypertrophied cardiocytes. Circulation, 1994, 90(1): 533-555.
7 Hori M, Sato H, Fukunami M. Pathophysiology of cytoskeleton and extracellular matrix in failing myocardium. Japanese J of Clinical Medicine, 1993, 51(5): 1191-1197.
8 D’xAndrea LD,Guido L,Roberto F.Targeting angiogenesis:structural characterization and biological properties of a denovo engineered VEGF mimicking peptide.PNAS,2005,102(40):14215-14220.
作者单位： 1 266071 山东青岛，青岛卫生学校
2 山东济南，山东大学医学院
3 山东青岛，青岛市妇女儿童医疗保健中心
4 山东青岛，青岛市卫生监督所
(编辑：张 彦)