点击显示 收起
【摘要】 目的 探讨肾宁水丸治疗系膜增生性肾小球肾炎（MsPGN）的作用机制。方法 通过建立牛血清白蛋白(BSA)所致MsPGN动物模型，运用光学显微镜、电子显微镜及原位杂交技术等检测手段，全面深入地探讨了肾宁水丸治疗MsPGN的作用机理。 结果 （1）MsPGN动物模型复制成功，光镜、电镜下病理检测类似人类MsPGN的病理变化；（2）肾宁水丸具有显著抑制肾小球系膜细胞（MC）增生、系膜基质（MM）增多的作用；（3）肾宁水丸有显著减少免疫复合物在肾小球系膜和基底膜（GBM）沉积的作用；（4）肾宁水丸可诱导MC凋亡。结论 肾宁水丸能够通过多途径综合作用机制起到抑制肾小球MC增生、MM增多的作用，并且可能参与MC的凋亡过程，是一个标本兼治非常有前途的中医药复方制剂。
【关键词】 肾宁水丸；系膜增生性肾小球肾炎；细胞凋亡；实验研究
Experimental study of mesangial prolifertive glomerulonephritis （MsPGN） with Shenning pill
LI Hong-wei， ZHANG Chun-jian， WAN Xi-chao,et al. Huangdao District TCM Hosptial,Qingdao 266500,China
【Abstract】 Objective To explore the functional mechanism of cure of mesangial prolifertive glomerulonephritis （MsPGN） with shenning pill.Methods Through establishing the animal model of MsPGN caused by bull’s serum albumin and using the test means of optic microscope, electron microscope, biochemistry etc, the functional mechanism of cure of MsPGN with shenning pill is fully presented in depth. Results (1) The animal model of MsPGN has been reproduced successfully and the pathologic changes of the animal model similar to that of man kind is seen through optic microscope and electron microscope;(2)Shenning pill can inhibit obviously the hyperplastic of mesangium cell and the increasement of cellular stroma;(3)Shenning pill can induce MC apoptosis. Conclusion Shenning pill can inhibit obviously the hyperplastic of mesangium cell and the increasement of capsule stroma can treat MsPGN by causes and symptoms and will be a prcspective Chinese medicine pharmaceutics.
【Key words】 shenning pill；mesangial prolifertive glomerulonephritis；apoptosis；experimental study
系膜增生性肾小球肾炎（MsPGN）是我国常见的原发性肾小球疾病，该型肾炎约占成人原发性肾小球疾病肾活检病例的24.7%～30.3%，是导致肾小球硬化等终末期肾病的主要因素之一［1］。MsPGN的发病机制仍然以免疫学说为主导，确切发病机制不明确，分子生物学、遗传基因学领域的研究仍处在初级阶段，对于该病无特异性的治疗药物。 本实验旨在阐明肾宁水丸治疗MsPGN的作用机制，为肾宁水丸进一步深入研究、审批新药，提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料 普通级雄性Wistar大鼠60只，体重（200±20）g，由哈尔滨医科大学实验动物中心提供。肾宁水丸由黑龙江省中医研究院制剂中心提供；雷公藤多甙片由湖南协力药业生产；牛血清白蛋白（BSA）、完全氟氏佐剂（FCA）为美国Sigma公司产品；大肠杆菌内毒素由哈尔滨医科大学微生物实验室提供；细胞凋亡检测试剂盒（POD法）为美国宝灵曼公司产品。JEM－1220透射电子显微镜，日本奥林巴斯公司生产。
1.2 方法
1.2.1 模型制备 采用邹万忠改良慢性血清病MsPGN动物模型制作方法［2］。（1）预免疫：将实验鼠单侧足垫皮下注射FCA 0.1mg加3mg BSA，并于第8天、第15天各加强1次；第21天，腹腔连续4次注射BSA生理盐水溶液（1%），时间间隔1h，注射剂量分别为每只0.05ml、0.1ml、0.15ml、0.3ml，并于第22天晨加强1次，剂量为0.2ml；（2）免疫：从第22天开始实验鼠予以BSA生理盐水溶液（0.5%）尾静脉注射与腹腔注射隔天交替进行，尾静脉注射量从0.5mg/只开始，每次增加0.5mg，至2.5mg为止，腹腔注射量为尾静脉注射量的2倍，共10天；（3）辅助免疫：于第32天（免疫10天后）予以BSA生理盐水溶液（0.5%）3.0mg/只尾静脉注射，后每周加量0.5mg至5.0mg为止，第35天尾静脉注射大肠杆菌内毒素0.1μg/只。
1.2.2 分组及给药 造模前将大鼠随机分为6组，分别为：肾宁水丸高剂量组（n=10），中剂量组（n=10），低剂量组（n=10），雷公藤多甙阳性对照组（n=10），模型对照组（n=10），空白对照组（n=10）。各组于第36天给药直至第70天，给药剂量按陈奇主编《中药药理研究方法学》剂量折算公式换算［３］，将肾宁水丸溶于生理盐水，配制成悬混液，分别予以高、中、低剂量组3.24g/（kg·d）、1.62g/（kg·d）、0.81g/（kg·d） (含生药量)，2次/d灌胃；雷公藤多甙片配制成生理盐水溶液，予以阳性对照组8.1mg/（kg·d）（含药量），2次/d灌胃；模型及空白对照组予以同体积的生理盐水，2次/d灌胃。全部实验共70天。
1.2.3 肾脏病理检查 第70天各组大鼠禁食12h，断颈处死后取同侧肾脏。（1）HE染色：按系膜细胞（MC）及系膜基质（MM）增生程度，将MsPGN分为轻、中、重三级进行检测［4］；（2）电子显微镜标本制作：2.5%戊二醛固定，脱水，包埋，切片（1μm），染色，封片，观察肾小球超微结构。
1.2.4 细胞凋亡测检（TUNEL）［5］ 根据每张切片阳性反应颗粒占细胞总数的比例定为：阴性（－），未见或偶见阳性颗粒；阳性（+），阳性颗粒少于1/3；中等阳性（++），阳性颗粒少于2/3；强阳性（+++），阳性颗粒在2/3以上［５］。予以半定量计分l、2、3、4分别对应（－）、（+）、（++）、（+++）。
1.2.5 统计学方法 定性资料采用χ2检验,等级资料采用Ridit分析。组间比较采用方差分析，自身前后比较用t检验。
2 结果
2.1 动物存活情况 第21天模型对照组大鼠有1只死亡（死因不明，疑为腹腔注射时感染），第22天尾静脉注射时模型对照组、高、中剂量组各有1只死亡，低剂量组有2只死亡（5只均死于急性变态反应）。实验第40天后大鼠出现活动差，皮毛无光泽，足肿胀明显，饮食无明显减少。
2.2 肾宁水丸对大鼠肾脏病理改变的影响
2.2.1 光镜 各组大鼠MC、MM增生情况见表1。
模型对照组：肾小球MC增生（>4个/系膜区），MM中度增生，毛细血管壁增厚、局灶性纤维素样坏死，小动脉壁透明样变性。
高剂量组：MC不增多，MM轻度增生（系膜区宽度不超过毛细血管腔），毛细血管壁无增厚，肾小管上皮部分颗粒样变性，肾间质无炎细胞浸润及纤维化。
中剂量组：肾小球MC及MM轻度增多，小管上皮可见玻璃样变性（细胞核周围疏松）、颗粒状变性。
低剂量组：肾小球MC增多，MM轻中度增生，毛细血管壁增厚，腔内有炎细胞浸润，小管损伤严重，以近曲小管尤为明显。 阳性药物组：个别肾小球MC增多，MM无增生，毛细血管壁局灶性纤维素样坏死。表1 各组大鼠MC、MM增生情况 注：与空白对照组比较※P＜0.05，与模型对照组比较△P＜0.05、△△P＞0.05，与阳性对照组比较▲P＞0.05
从表1可以看出造模第70天模型对照组较空白对照组MC及MM增生显著（P＜0.05），提示造模成功；治疗后高剂量组、阳性对照组与模型对照组比较病理改变显著减轻（P＜0.05），而中、低剂量组与模型对照组比较病理改变差异无显著性（P＞0.05）；高剂量组与阳性对照组在抑制MC、MM增生方面差异无显著性（P＜0.05）。
2.2.2 电镜检查结果 模型对照组：系膜区可见电子致密物沉积，系膜增多，毛细血管壁无增厚，内皮细胞核增多，间质动脉肌层空泡样变性。
高剂量组：系膜区及GBM结构完好，未见电子致密物沉积，毛细血管壁未增厚，静脉腔内可见炎细胞浸润。
中、低剂量组：系膜区可见大量电子致密物沉积，毛细血管腔内可见炎细胞浸润，小管上皮损伤严重且可见大量溶酶体。
阳性药物组：系膜区轻度增生，可见少量电子致密物沉积，小管上皮可见少量溶酶体核。
2.3 细胞凋亡检出情况 见表2。表2 肾宁水丸对细胞凋亡的影响
注：与模型对照组比较※P＜0.05，与阳性对照组比较▲P＞0.05，与高剂量组比较△P＜0.05
原位末端标记法检测细胞凋亡结果显示：空白对照组与模型对照组大鼠MC凋亡阳性表达极少，仅肾小管上皮细胞少量表达；高剂量组与阳性药物组细胞凋亡阳性表达较多，与模型对照组比较差异有显著性（P＜0.05），表达主要表现在系膜区，在肾小管内也可见少量阳性表达；高剂量组与阳性药物组比较差异无显著性；中、低剂量组凋亡细胞阳性检出率较少，与高剂量组相比差异有显著性。
3 讨论
3.1 肾宁水丸抑制MC、MM增生的机制 本实验表明肾宁水丸能减轻MsPGN大鼠病变程度，从而延缓肾小球硬化过程，总结其作用机制，可能为：（1）调节机体免疫能力，减轻免疫复合物对肾小球的直接损伤，降低肾小球滤过膜的通透性。有报道黄芪可显著增强细胞免疫，减少尿中蛋白的排出，增强代谢功能，党参可促进巨噬细胞吞噬能力，增强免疫功能［6］。（2）通过抗凝手段，抑制MC增生和MM分泌，缓解肾小球纤维化、硬化的发生。凝血机制紊乱在增生性肾小球肾炎中广泛存在，肾宁水丸中起活血化瘀作用的主要为水蛭、益母草。水蛭其主要有效成分为水蛭素，有报道用水蛭素进行抗凝治疗MsPGN，不仅能够防治微循环血栓并发症，而且可能具有间接的抗增殖和抗炎作用，并可作为特异性凝血酶阻断剂阻滞凝血酶对MC ICAM-1 mRNA的上调作用［7］。现代药理研究证明益母草具有明显的抗血栓形式作用及溶栓作用。大鼠口服益母草水煎液（相当生药15～20g/只）能产生较强的抗血栓形成作用，使血栓形成时间延长、尺度缩短、重量减轻，同时外周血小板计数减少，聚集功能减弱。
3.2 肾宁水丸诱导MC凋亡机制的探讨 细胞凋亡理论在增殖性肾炎中的应用是近几年才兴起的，对于药物诱导MC凋亡的研究多集中在激素、免疫抑制剂方面。通过本实验研究发现，肾宁水丸能诱导MC凋亡，究其原因可能是双向调节免疫之党参、黄芪共同作用的结果。同时通过本实验推测水蛭素可能具有间接的抗炎和抗增殖作用，但水蛭素作为一种新型抗凝剂是否可直接诱导MC凋亡尚待进一步证实。
3.3 肾宁水丸的组方及配伍意义 肾宁水丸是导师王铁良教授根据多年临床经验制成的经验方，方由黄芪、党参、寸冬、茯苓、黄芩、车前子、坤草、水蛭、甘草等组成，主治气阴两虚兼夹湿热瘀血证。肾宁水丸重用党参、黄芪，其中党参味甘性平且守而不走，补气兼能益阴；黄芪味甘性温且走而不守，性善益气升提，二药共奏益气固肾之功而为君药。茯苓补脾益气兼能利水渗湿可助党参、黄芪益气之功，使益气而不敛邪；麦冬滋阴清热除烦，二者共为臣药。车前子清热利湿性趋于下，黄芩善清上焦湿热，二者宣上泄下使湿热之邪尽去；水蛭辛、咸、平，入血分，为破血逐瘀之佳品，可入络搜血，益母草活血利水，以上诸药共为佐药。甘草调和诸药，且可解水蛭之小毒而为使药。诸药共奏益气养阴、清热利湿活血之功，使气、血、水兼顾，补不碍邪、攻不伤正，而为攻补兼施之方。
本实验初步探讨了肾宁水丸治疗MsPGN的疗效，其复方有效作用成分尚待证实，并对肾宁水丸诱导MC凋亡方面进行了初步探索，但其诱导MC凋亡的机制及何种有效成分诱导凋亡尚需进一步证实。
*基金项目：黑龙江省自然科学基金资助（编号：GC01C145-03）
【参考文献】
1 Okada H,Konishi K,Nakazoto Y,et al.Interleukin-4 expression in mesangial proliferative glomerulonephritis.Am J Kidney Dis,1999,23:242.
2 邹万忠.改良慢性血清病大鼠系膜增生性肾小球肾炎模型的建立.肾脏病与透析肾移植杂志，1999，5（3）：21-25.
3 陈奇.中药药理研究方法学.北京：人民卫生出版社，1994，286-288.
4 王海燕.肾脏病学，第2版.北京：人民卫生出版社，1996，648-654.
5 彭黎明，王曾礼.细胞凋亡的基础与临床.北京：人民卫生出版社，2004，378-391.
6 张佩青．张琪从湿热论治慢性肾病举要．黑龙江中医药，1995，1（4）：26-27.
7 师琐栓，陈香美.细胞间粘附分子-1在非IgA系膜增殖性肾小球肾炎病变中表达的定量分析.临床与实验病理学杂志，1996，12（1）：31-33.
8 Morel M,Leathem A,Ricet G.Glomerular abnormalities in nonsystemic diseases. Relationship between findings by light microscopy and immunofluorecence in 433 renal biopsy specimens.Am J Med,2004,53(2):170-184.
作者单位：1 266500 山东青岛，青岛市黄岛区中医院 2 150040 黑龙江哈尔滨，黑龙江省中医研究院肾一科