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【摘要】 目的 研究大鼠脑出血后不同脑区H+-ATPase β亚基mRNA表达的动态变化规律和针刺的调节作用。方法 将雄性Wistar大鼠随机分为空白组、模型组、针刺组，又分为24h、72h、168h三个时间小组，采用胶原酶/肝素联合注入法制备脑出血大鼠模型，给予百会透太阳穴电针治疗，RT-PCR法观测三个部位脑组织（血肿周围、左侧侧纹状体和右侧海马）H+-ATPase β亚基mRNA表达的变化。结果 脑出血后三个部位均出现H+-ATPase β亚基mRNA的表达变化。24h后血肿周围H+-ATPase β亚基 mRNA的表达下降，并逐渐恶化（72h,168h）。对侧镜像部位（左侧侧纹状体）仅在早期24h出现了轻微的H+-ATPase β亚基mRNA的表达下降，随后即恢复正常。远隔部位（右侧海马）病变程度轻于血肿周围，但重于对侧，72h后也出现H+-ATPaseβ亚基mRNA的明显下降。针灸组血肿周围72h才出现线粒体H+-ATPase β亚基mRNA下降，血肿对侧未见异常变化，远隔部位168h才出现下降；针刺组各时间段病变程度明显轻于模型组。结论 针刺对三个部位H+-ATPaseβ亚基mRNA具有调节作用，针刺具有空间效应。
【关键词】 头针 脑出血 针刺效应 质子转移性三磷酸腺苷合成酶β亚基基因
Experimental study of scalp-acupuncture effect on the express of H+-ATPase β subunit mRNA after rat intracerebral hemorrhage
BAO Chun-ling，DONG Hong-sheng.Yueyang Hospital of Shanghai University of TCM, Shanghai 200437，China
【Abstract】 Objective To study the rule of H+-ATPase β subunit mRNA’s express in different brain region after rat intracerebral hemorrhage and scalp-acupuncture regulative effect.Methods The Wistar rats were divided into 3 groups: normal group, model group, acupuncture group. Every group was divided into three time groups（24h,72h,168h）. The model of intracerebral hemorrhage in rat was made with collagense VII/heparini infusion, and treated them by electro-acupuncture on Baihui-Taiyang points. RT-PCR method used to detect H+-ATPase β subunit mRNA on three regions（（perihematoma, left striate body, right CA）.Results H+-ATPase β subunit mRNA changed in three brain regions after rat intracerebral hemorrhage. After 24h, the express of H+-ATPase β subunit mRNA decreased in perihematoma and aggravated gradually. On the left Cpu, the express of H+-ATPase β subunit mRNA decreased slightly only in 24h. On the right CA, the degree of pathological changes worse than perihematoma and better than left Cpu, the express of H+-ATPase β subunit mRNA decreased from 72h.The express of H+-ATPase β subunit mRNA in the three time on the three regions higher than the model group.Conclusion Scalp acupuncture can regulate the express of H+-ATPase β subunit mRNA in the three brain regions. Scalp acupuncture have the space effect.
【Key words】 scalp acupuncture;intracerebral hemorrhage;acupuncture effect;H+-ATPase β subunit gene
三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP）是大脑的主要能源物质，其绝大多数由线粒体的氧化磷酸化过程产生。如线粒体功能出现明显异常，则会不可避免的造成细胞能量物质的供应障碍。线粒体是一种对各种损害异常敏感的细胞器，当脑血流量仅轻度下降时线粒体的电子传递链即可出现异常［1］。目前无论是在缺血性脑损害还是在脑外伤等疾病中，都已发现神经细胞线粒体功能遭受破坏［2，3］。目前认为改善脑出血后缺血缺氧关键的作用环节在于改善细胞的能量代谢，延缓和抑制继发性能量衰竭的发生。本研究选择ATP合成关键酶H+-ATPase β亚基 mRNA表达为研究对象，对脑多部位进行连续观察，以期深入认识病理变化规律，揭示针刺治疗脑出血的作用机制，从而证实头穴针刺的空间效应特性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠56只，体重 220～280g，由黑龙江中医药大学动物实验中心提供。
1.1.2 主要试剂 胶原酶VII （Sigma America），肝素12.5U/μ1 （上海生化），DEPC（上海申友），dNTP（大连宝公司），Trizol（GIBCO），ExTaq DNA聚合酶（大连宝公司），中分子量蛋白Marker（大连宝公司），其他试剂均为进口或国产分析纯。
1.1.3 主要仪器 立体定位仪（Kasuya Japan Narishinge ST-85-28）；微量进样器（上海高欣玻璃仪器），牙科钻头（北京医疗设备厂）；华佗牌针灸针（苏州医疗用品厂）；电针治疗仪:G6805-II型（上海医用电子仪器厂）；高速冷冻离心机（Beckman Allegra TM 21R America），微量离心机（Eppendorf），PCR自动循环仪（KIN ELMETR Gen Amp PCR system 2400），电泳仪（东方特力工贸公司）,微波炉（National）,超净工作台（Forma Scientific）,漩涡振荡器（杭州仪表电机厂）。
1.2 方法
1.2.1 动物分组 健康雄性（Wistar）大鼠56只，随机数字表分成以下三组：空白组：健康大鼠。模型组：向脑内尾状核中心部注入2μl胶原酶/肝素的生理盐水（含胶原酶0.5U和肝素7U）。针刺组：造模成功后给予头穴电针。模型组和针刺组又分为24h、72h、168h三个时间点，每小组各8只动物。
1.2.2 造模方法 参照任泽光的方法［4］。动物经10%水合氯醛腹腔麻醉（400mg/kg体重），头顶备皮后将动物固定于三维立体定位仪上，局部皮肤采用碘酚消毒，正中矢状切开头皮，剥离骨膜，调节门齿托的高度，使动物的前、后囟处于同一水平。以前囟为坐标原点，向后0.2mm，向右2.9mm，确定注射点坐标，用牙科钻钻孔（直径1.0mm）（右尾状核位置），用微量注射器吸取含0.5U/μl胶原酶的生理盐水和7U/μl肝素的生理盐水各1.0μl，沿钻孔处竖直、5min缓慢进针6.0mm，5min缓慢匀速注射后，留针10min,缓慢退针5min，钻孔处填入明胶海绵止血，撒少许青霉素粉防止局部感染，缝合皮肤。各组动物清醒后放回笼内饲养。
1.2.3 针刺方法 取穴：百会穴在大鼠头顶两耳根连线与前后中线交点（相当于人体百会处）。太阳穴在外眼角与耳之间的凹陷中（相当于人体太阳穴），参照华兴帮等制定的《实验动物穴位图谱》。操作：常规消毒，以0.25mm×30mm毫针两根，分别刺入百会（向右前太阳穴方向）和右侧太阳穴。将G-6805 Ⅱ型电麻仪正极接百会穴毫针，负极接太阳穴毫针，连续波，频率120次/min,强度1mA，留针30min。从造模后大鼠清醒开始进行针灸治疗。每天进行电针治疗1次。
1.2.4 观测部位 A部位：血肿周围3mm范围内脑组织；B部位：对侧半球镜像（健侧尾状核）；C部位：血肿远隔（病侧海马）。
1.2.5 试剂配制 0.1% DEPC水配制：按 1：1000 的比例加DEPC于双蒸水中，充分摇匀，静置过夜后高压灭菌，4℃保存备用。
1.2.6 RT-PCR法 取材：各组动物指定时间点迅速断头取脑。暴露被覆蛛网膜的脑组织，换用经过高温高压处理、DEPC水浸泡过的器械，剔掉蛛网膜取出脑组织，置于干冰上，迅速分离各部位脑组织，分析天平称重，快速放入已标记好的冻存管内，置于液氮中保存备用，整个过程不超过3min。引物设计：根据基因库GenBank（http://www. ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/nucleotide.htlm）中索出大鼠H+-ATPase βsubunit及β-action cDNA完整序列。参考相应文献，收录的相关基因mRNA序列，用Oligo6.0软件在5′和3′端分别设计需检测基因的引物，设计的引物通过internet网以Blast对比引物与基因库之间的同源性。经检验引物的内部无发夹结构，引物之间无二聚体形成，引物与基因库之间无非特异性同源区域。引物由上海博亚生物技术有限公司合成。H+-ATPase UP: 5′GGA GGT AGC CCA GCA TTT A 3′19 ；H+-ATPase DOWN：5′TTC CCA CCC TTG GCG TAT G 3′19（312bp）。β-actin up：5′tgg aga aga gct acg agc tgc ctg 3′24β-actin down：5′gtg ccg cca gac agc act gtg ttg 3′24（212bp）。总mRNA的提取：取出冻存于液氮中的大鼠脑组织，在冻存管中研磨组织，每管加入1ml TRIzol裂解液，剧烈振荡。室温静置5min。再加入200μl氯仿，用力颠倒离心管以混匀。静置5min后，12000g离心10min。小心将水相移至1.5ml离心管中，再加入500μl异丙醇，振荡混匀。于-20℃沉淀1h。12000g于4℃离心15min。小心地弃上清。加入1ml 75%乙醇漂洗， 12000g于4℃离心5min。弃上清。室温静置5～15min使RNA沉淀干燥。加入9.5μl的DEPC水溶解RNA。反转录cDNA的合成：反应体系的体积为20μl，在9.5μl RNA（溶于DEPC水）中加入1μl下游引物，混匀后放置在70℃水浴锅中作用5min，再加入4μl 5×Buffer；0.5μl HPR I；4μl dNTP；1μl MLV RNase（反转录酶），配好反应液后42℃水浴1h，冰浴冷却2min，所得反应液用于PCR反应。PCR产物克隆：在0.5ml的微量离心管中加入以下试剂：反转录产物1μl，10XTaq DNA聚合酶缓冲液 2.5μl，4种dNTP混合物（各自浓度为205mM） 2μl，上游引物 1μl（25pmol/μl），下游引物 1μl（25pmol/μl）；EX Taq DNA聚合酶0.125μl，灭菌去离子水加至总体积为25μl。将上述反应液混合后，于PCR仪上进行扩增。循环参数为：95℃ 5min；94℃ 45s；55℃45s；72℃50s 34个循环，72℃延伸10min。循环结束后70℃最后延伸7min，反应结束后进行熔解曲线分析，以鉴定PCR产物的特异性。使用Sequence Detection System软件（version1.0,Applied Biosytems，USA）分析PCR过程各检测样本的Ct（Threshold of cycle）值。 DNA琼脂糖凝胶电泳：使用2％琼脂糖凝胶检测扩增的目的条带，用Gene Genius全自动凝胶成像仪扫描图像和分析数据，并对PCR产物定量。
1.2.7 统计学处理 数据以均数±标准差（x±s）表示，SPSS13.0 统计软件分析处理，采用方差分析，多组间均数两两比较采用q检验，以P<0.05作为差异有显著性。
2 结果
针刺对脑出血后脑组织线粒体H+-ATPase β亚基 mRNA 表达的影响（见表1，图1～3）：（1）F部位间54.29，P<0.01；F组间80.142，P<0.01； F时段间20.54，P<0.01。经两两比较q检验，病变严重程度依次为A、C、B部位；168h、72h、24h彼此间有差别。模型组、针刺组、空白组彼此间有差别。（2）三部位内的比较：A部位：F组别间103.82，P<0.01；F时段间45.03，P<0.01。经q检验，168h、72h、24h、空白组间彼此有差别；模型组、针刺组、空白组彼此间有差别。B部位：F组间3.447，P<0.01； F时段间1.502，P>0.01。模型组与针刺组、空白组间有差别。C部位：F组间17.531，P<0.01； F时段间7.25，P<0.01。经q检验，168h分别与72h、24h、空白组间差异有显著性。模型组、针刺组、空白组彼此间有差别。（3）三个时段内的比较24h：F部位间86.983，P<0.01；F组间38.625，P<0.01。经两两比较q检验，模型组分别与针刺组、空白组有差别。72h：F部位间29.636，P<0.01；F组间4.725，P<0.01。经两两比较q检验，A、C、B彼此间有差异；模型组、针刺组、空白组彼此间有差别。168h：F部位间50.653，P<0.01；F组间14.687,P<0.01。经两两比较q检验结果同72h。表1 针刺对脑出血后线粒体H+-ATPase β亚基 mRNA 表达的影响 注：与同部位空白组比较，*P<0.05；与同部位相同时间点模型组比较，# P<0.05
3 讨论
对脑组织线粒体分子生物学机制的研究表明：线粒体 DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）结构、功能具有明显特殊性［5，6］：（1）它全部转录，无内含子；（2）双链编码，高度浓缩；（3）多个拷贝，拷贝数具有器官差异性；（4）一个基因执行多个功能。mtDNA 缺少蛋白保护，又处在高氧化环境中，所以其突变率比 nDNA（核 DNA）高 5～17 倍。上述特点导致其成为各种损害因子攻击的最主要、最脆弱的靶目标，进而引起线粒体功能障碍，最终造成细胞的衰老与死亡。H+-ATPase 位于线粒体内膜由五种亚基（α3β3γεδ）组成［7］，其主要功能是利用电子传递过程释放的能量催化 ADP 和无机磷合成 ATP，参与氧化磷酸化的最后途径。H+-ATPase 对各种损伤因素敏感，心肌缺血及再灌注早期 H+-ATPase 活性即发生变化，氧自由基可以使大鼠心肌线粒体 H+-ATPase合成活性降低［8］。
本文结果表明，脑出血后三个观测部位均出现不同时间和不同程度的H+-ATPase β亚基 mRNA的表达变化。模型组：脑出血24h后血肿周围H+-ATPase β亚基 mRNA的表达下降，并逐渐加重。对侧镜像部位仅在早期24h出现了轻微的H+-ATPase β亚基 mRNA的表达下降，随后即恢复正常。远隔部位病变程度轻于血肿周围，但重于对侧，72h后时出现H+-ATPaseβ亚基mRNA的明显下降，晚于血肿周围。H+-ATPaseβ亚基mRNA的表达降低，将使H+-ATPase合成活性减低，呼吸链和氧化磷酸化的通路被阻断，ATP合成减少。有研究表明脑出血初期H+-ATPase 代偿性的活性增高，增加ATP的生成量，来满足脑组织对能量的需求。随着时间的推移，代偿性的活性增高不能维持ATP的生成量，乳酸的堆积，ATP 降解生成的次黄嘌呤、自由基等对线粒体的功能结构造成严重损伤，使H+-ATPase活性降低。该酶活性的降低又进一步造成ATP生成障碍，二者互为因果，使酶的活性持续下降，ATP的合成亦持续下降，最终造成能量代谢的衰竭［9］。另外，氧化磷酸化的最后途径脑ATP存储是有限的，由于细胞内ATP减少，Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶活性降低，Na+/ Ca2+交换平衡失调，加之缺血缺氧，细胞膜的通透性增加，再灌注时Ca2+进入细胞及线粒体内，导致细胞及线粒体内Ca2+超载，引起细胞功能的一系列障碍［10，11］。脑出血后对侧半球和远隔部位也发生不同程度病变，分析原因与该部位脑血流的下降有关。Yang等［12］在大鼠尾状核出血模型中测得rCBF的变化，在出血后1h的同侧和对侧基底节及皮质的rCBF均下降，4h后有所回升，48h后又再次下降。研究显示，基底节病变引起同侧皮层的rCBF下降，推测为血肿周围缺血性半暗区的延伸；而一侧病变引起对侧相应部位的rCBF下降，称之为“镜像”远隔功能障碍，而引起对侧小脑半球的rCBF的下降，则称为“交叉性”远隔功能障碍，二者的机制推测为神经传导通路的抑制所致，其原因可能与皮质、桥脑、小脑束、齿状核、红核、丘脑束等传导束受累，引起血管的调节功能障碍，导致rCBF下降［13～15］。SPECT、PET的研究表明脑出血后多部位包括远隔部位存在脑血流的下降。脑出血后颅内压增高、脑血流自动调节损害、脑水肿和脑组织移位造成血供障碍也使远隔区域的脑血流持续处于较低水平［16，17］。
针刺组H+-ATPaseβ亚基mRNA的病变明显晚于模型组，血肿周围72h才出现线粒体H+-ATPaseβ亚基mRNA下降，血肿对侧未见异常变化，远隔部位168h才出现H+-ATPaseβ亚基mRNA下降；而且各时间段病变程度明显轻于模型组。原因可能与笔者以往结果表明针刺能扩张脑内小动脉，促进新生血管的形成，功能性毛细血管开放，增加缺血性脑组织的血液灌注有关。头穴针刺治疗后早期即解除血管的痉挛状态，使微血管开放为周边侧支代偿血流进入缺血区创造条件；同时血流的恢复使缺血组织获得了血氧供给，使微血管本身减轻了缺血的损伤，从而使微血管和代偿血流间出现了良性循环。针刺治疗能明显调节H+-ATPaseβ亚基mRNA的表达，从而保障线粒体中的氧化磷酸化作用和ATP的供应，减轻钠泵损伤，氧供充足减少乳酸堆积。针刺对多部位具有治疗作用，针刺具有空间调节效应。
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（编辑：悦 铭）
作者单位：基金项目：国家自然基金资助课题（编号：30500677），黑龙江省研究生创新基金资助课题（编号：YJSCX2005-214HLJ） 1 200437 上海，上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院针灸科 2 上海，上海市针灸经络研究所（通讯作者）