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【摘要】 目的 探讨外周注入P物质受体拮抗剂后,观察电针足阳明经穴是否能干预SP拮抗剂对胃电和脑肠肽的抑制作用。方法 将32只大鼠分为4组，A（对照）组、B（足三里）组、C（SP拮抗剂）组、D（足三里加SP拮抗剂）组。将SP拮抗剂（D-Arg1,Trp7,9,Leu11-Substance P）静脉滴注以阻断外周P物质受体。以胃电慢波振幅变化率、快波峰簇数及胃窦组织胃动素（MTL）、P物质（SP）等为指标，观察SP 受体阻断后针刺足三里对胃电及脑肠肽的影响。结果 针刺足三里使大鼠胃电振幅变化率及快波峰簇数增高，与对照组比较差异有显著性（P<0.05）;与此同时胃窦组织内MTL、SP升高,与对照组比较P<0.05。静滴SP 受体拮抗剂后，胃电振幅变化率、快波峰簇数及脑肠肽含量均呈现下降趋势，与A、B组比较差异均有显著或非常显著性（P<0.05或P<0.01）。D组滴注SP拮抗剂再加上电针足三里后上述胃电活动指标部分恢复，明显高于C组（P<0.01），但仍低于B组水平（P<0.05），MTL、SP含量也呈类似变化。结论 电针足三里可部分取消SP受体拮抗剂对胃电抑制效应，该项效应可能与电针使胃窦组织内胃动素及SP含量增高有关。
【关键词】 足三里 胃电生理 P物质 SP受体 脑肠肽
The interventional effect of SP antagonist inhibiting gastric electrical activity and brain-gut peptide by acupuncture at “Zusanli” point
YI Shou-xiang, YAN Jie, LIN Ya-ping,et al.Acupuncture, Moxibustion and Massage College of Hunan University of Traditional Chinese Medicine, Changsha 410007,China
【Abstract】 Objective To explore the effect of electro-acupuncture at Foot-Yangming meridians （points） on gastric electrical activity and brain-gut peptide after peripheral substance P （SP） receptor were blocked.Methods 32 rats were divided into 4 groups, including group A （control group）, group B（“Zusanli” group）, group C （ SP antagonist group） and group D （“Zusanli” and SP antagonist group）. Blocking peripheral SP receptor by intravenous drop infusion with the SP antagonist （D-Arg1,Trp7,9,Leu11-Substance P） and then observing the effect of electro-acupuncture at “Zusanli” point on gastric electrical activity and brain-gut peptide by measuring the slow wave amplitude variety percentage, number of fast wave clusters of EGG and the content of motilin （MTL） and SP in gastric antrum.Results After electro-acupuncture at “Zusanli” point ,the slow wave amplitude variety percentage and number of fast wave clusters of EGG were raised, showing significance different（P<0.05）comparing with control group,. At the same time the content of motilin （MTL） and SP in antrum tissues increased，comparing with control group（P<0.05）.After infusing with the SP antagonist via vein，the above slow wave amplitude variety percentage, number of fast wave clusters of EGG were decreased, comparing with group A and B, showing distinguished contrast（P<0.05）.After infusing with the SP antagonist and electro-acupuncture at “Zusanli” point ,the above gastric activity parameters were restored partially, higher than the lever in group C（P<0.01）,but still lower than the level in group B（P<0.05）. The change of contents of MTL、SP were similar.Conclusion The suppressive effect of SP antagonist on gastric electrical activity could be partially weakened by electro-acupuncture at “Zusanli” point, may be due to increased of the content of MTL and SP in gastric antrum tissues.
【Key words】 Zusanli； gastric electrophysiology；substance P （SP）；substance P receptor；brain-gut peptide
为了探讨足阳明经与胃相互联系通路及其与P物质关系，本研究采用P物质（SP）受体拮抗剂（D-Arg1,Trp7～9,Leu11-Substance P） 静脉滴注，与此同时观察针刺足阳明经穴对大鼠胃电活动影响，分析胃窦内的胃动素（MTL）、P物质（SP）等含量的变化，试图阐明针刺足阳明经穴对胃电活动影响的外周神经通路及与脑肠肽的关系。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 健康成年大鼠32只，体重25O～350g，雌雄不拘，由本院实验动物中心提供。根据实验需要随机分为4组。（A）对照组：静滴0.9%NaCl溶液20min，静滴前后分别记录胃电60min；（B）足三里组：静滴0.9%NaCl溶液同时针刺足三里20min，静滴前后分别记录胃电60min； （C）SP拮抗剂组:以1μg/（kg·h） 作尾静脉滴注；（D） SP拮抗剂加足三里组。C、D 组除静滴药物外，其余步骤同A、B 组。
1.2 手术方法及术后处理 大鼠称重，10%乌拉坦1ml/100g腹腔注射麻醉。动物仰卧位固定于手术台上，剑突下腹部正中切口暴露胃体、胃窦部，在胃窦及胃体部分别埋置直径为2mm 铂金电极，胃窦电极距幽门括约肌0.5cm，胃大弯电极距胃窦部电极约1cm 处，电极导线经皮下自两肩胛骨之间引出体外，固定在一带盖的小塑料套管内,缝合皮肤,消毒及抗感染。动物隔离饲养4～5天，禁食1天后作胃电记录。
1.3 大鼠胃电记录及分析方法 胃电记录采用二道生理记录仪，两电极间并联22F（慢波）或50F（快波）电容，信号输入放大器，参考电极置于尾根部。同步记录胃电快波和慢波。慢波参数：时间常数2s，高频滤波10Hz，灵敏度5mV/cm 或2mV/cm；快波参数：时间常数0.02s，高频滤波30Hz，灵敏度1mV/cm。记录纸速10mm/min。
观察指标：（1）平均振幅变化率：以慢波3min为一区段，共取4～5个区段，计算各区段振幅的平均值。处理前后比较平均振幅变化率（%）：平均振幅变化率（%）=（效应值-正常值）/效应值×100。（2）平均峰簇数（个/10min）：以10min快波为一区段，测取3个区段内发放的峰簇数，并计算处理前后快波平均峰簇数的差值。
1.4 胃窦组织标本提取及脑肠肽含量放免测定法（RIA） 实验结束后摘取胃窦，用0.9% NaCl溶液冲洗,称重后按1：10比例加0.9%NaCl溶液煮沸3min，0.5mmol/L 冰醋酸匀浆，再加同量NaCl液中和，离心取上清液-20℃冰箱保存，以备作脑肠肽测定。MTL及SP测定采用RIA，试剂盒由北京美迪科公司提供，由中南大学湘雅医院中心实验室协助测定。
1.5 刺激部位及方法 足三里取穴参考华兴邦动物穴位图谱。电刺激方法用G6805电针仪，电针频率7～10Hz疏密波，强度以肌肉或针柄微颤为度，电针时间20min。
1.6 统计学方法 数据以x±s表示，同组针刺前后观察值比较采用配对t检验，多组间显著性检验采用方差分析，组间两两比较采用q检验。
2 结果
2.1 静注SP拮抗剂后针刺足三里对大鼠胃电的影响 见表1。
大多数禁食大鼠胃电慢波呈周期性节律变化，一般可分为高活动相和低活动相，高活动相可见到持续时间较长的连续不规则的大峰簇，在一次记录中呈周期性出现。快波为双向不对称针形波,多以峰簇发放形式出现，峰簇多发生在慢波平台上。静注SP拮抗剂后针刺足三里对大鼠胃电的影响见表1。表1 SP拮抗剂与针刺足三里对胃电振幅及 峰簇数影响注:与A组比较※P<0.05，※※P<0.01；与B组比较△P<0.05，△△P<0.01，与C组比较▲P<0.05，▲▲P<0.01表1显示与对照组比较针刺足三里可使胃电慢波振幅变化率、快波峰簇数升高（P<0.05或0.01）。静滴SP拮抗剂后，胃电振幅下降27.85±23.04%，明显低于 A、B组（P<0.01）。拮抗剂加上针刺足三里后振幅变化率有所回升，明显高于C组（P<0.01），但仍低于B组（P<0.05）。快波峰簇数C组明显低于B组 （P<0.01）；D组有所恢复。以上说明SP对慢波振幅及快波峰簇发放均呈抑制效应。针刺足三里可使被抑制胃电得到部分恢复，但仍未恢复至给药前水平，显示电针能部分取消SP拮抗剂对胃电抑制效应。
2.2 静注SP拮抗剂后针刺足三里对大鼠胃窦内脑肠肽的影响 见表2。 表2 SP拮抗剂与针刺足三里对胃窦组织 内脑肠肽的影响注:与A组比较※P<0.05，※※P<0.01；与B组比较△P<0.05，△△P<0.01；与C组比较▲P<0.05表2显示：针刺足三里后胃窦组织内MTL及SP含量较对照组升高（P< 0.01）。而SP拮抗剂组其胃窦组织内SP与对照组比较差异无显著性，MTL含量低于足三里组（P< 0.01）。SP拮抗剂+针刺足三里组其MTL和SP含量明显高于C组和A组。说明针刺足三里使胃窦MTL及SP含量增高。注入SP拮抗剂后与对照组比较胃窦内MTL、SP含量无明显改变。说明针刺足三里在部分取消SP拮抗剂对胃电抑制效应的同时也伴随胃窦组织内胃动素及SP含量增高。
3 讨论
P物质（Substance P）是世界上发现最早的神经肽,由Von Euler 和Gaddum于1931年在马肠中提取乙酰胆碱时发现,因当时不知其化学性质,故取名P物质。直到20世纪70年代对它的研究才有了突破性进展,随着放射免疫学和免疫组织化学技术的应用,SP的研究工作已得到迅速发展， 现已查明SP是速激肽（TK）家族的一种,来源于前速激肽原（preprotachykinin,PPT）A基因编码的三种PPT,即: α-PPT, β-PPT和γ-PPT［1，2］。
SP广泛分布于神经系统和外周组织中，其作用主要参与感觉信息传递［3，4］，痛觉调制［5］，消化［6］，心血管活动［7］，神经内分泌［8］，呼吸及行为等活动的调节［9，10］。SP在外周对胃肠道运动有促进作用，外周SP由消化道内源性神经元或外在神经（迷走、内脏神经等）释放。它能强烈刺激下食管括约?⑽负突爻ζ交∈账酰鹘谖杆岱置冢?1］。
SP对胃肠道平滑肌有很强的刺激作用，它增强猫食管肌条的基础张力，使在体猫胃和幽门强烈收缩；在整体内SP增强小肠的节段性收缩和蠕动［1，12］。鉴于SP对胃肠平滑肌的强烈刺激作用和它在胃肠道的区域性分布，说明这种肽能神经在胃肠道的主要作用与胃肠运动有关。近年来不少研究表明某些促进胃肠动力的药物都与提高胃肠道局部SP的活性有关［13～15］。
在中枢神经系统中SP对胃功能的影响报道不一，最初的研究发现它能使胃内压下降，胃收缩活动下降。如荆浩等于大鼠侧脑室、尾核等微量注射SP，发现对胃肌电快波和胃运动产生抑制效应［16，17］。单纯电针“足三里”穴和单纯侧脑室注入P物质均可产生胃运动幅度下降和胃电频率下降［18］。而曲瑞瑶等却报道，侧脑室给予SP后反能引起胃窦运动明显增强［19，20］。
SP受体主要分布于脑和胃肠道，SP是通过与SP受体结合实现其对各种功能的调节作用。速激肽家族受体分为NK1、NK2和NK3，SP对NK1的亲和力较高，与NK2和NK3的亲和力较低，因而将NK1受体称为SPR（SP受体）［21～23］，SP受体属于G蛋白偶联家庭。受体激活后通过G蛋白调节第二信使的形成，引起1、4、5-三磷酸肌醇（IP3）和二酰基甘油（DAG）的形成，IP3动员细胞内储存的Ca2+，而DAG激活特异性蛋白激酶C异构体。除此之外，参与信息传导机制的还有cGMP、cAMP等信使物质。关于SP影响胃肠运动的信号转导机制表明，SP与受体结合后，通过G蛋白耦联受体途径，引起胞内游离钙离子增加，进而引起平滑肌细胞跨膜电位下降，当其达到阈电位时产生动作电位，而后通过兴奋收缩耦联触发平滑肌收缩［2，24］。
针刺对P物质的影响已有不少报道，且涉及镇痛、循经感传机制、免疫及胃肠活动等。如沈上、展淑琴等人报道，针刺镇痛效应与P物质参与有关［25～27］；电刺激诱发循经感传可激发同经线皮下P物质的释放，提出P物质可能是经脉线上传递信息的重要化学物质［28］；高巍等发现电针提高免疫功能与脑垂体和外周血中ir-SP活性增加有关［29］。有关针刺促进SP释放进而实现对胃肠功能的调节作用的报道更是屡见不鲜。如雷亚宁等发现电针大鼠双侧足三里，使小肠壁黏膜下神经丛和肌间神经丛SP免疫阳性反应明显增强［30］。刘健华等采用免疫组织化学方法揭示针刺足三里可能通过抑制孤束核（NTS）内侧亚核和连合核SP释放，并对胃功能产生兴奋作用［31］。田庆华等报道电针足三里可增加大鼠脑干SP基因表达，提示SP参与了针刺对胃肠运动的调节作用［32］。王东岩等采用霍尔效应记录家兔胃运动的方法，发现电针足三里使胃运动和胃电呈现抑制效应［33］。
本室以往的工作亦证实，针刺足阳明胃经天枢、足三里可激活SP能神经元，促进胃窦SP合成和释放，使抑制状态的胃运动得以恢复［34］。常小荣、邓元江等［35，36］发现电针足三里后胃电活动增强，同时血浆、胃窦内SP、MTL等脑肠肽含量出现同步性增高。笔者采用阿托品阻断M受体后再行针刺足三里,发现能使抑制状态的胃运动功能得以恢复，同时还对胃窦组织内SP及MTL有一定影响［37］。刘建华等发现电针足三里促进胃电活动时延髓迷走复合体SP免疫阳性纤维的光密度增强［38］。以上说明针刺对胃运动的调节作用确有SP的参与。
现已得知速激肽受体选择性的激动剂和拮抗剂有几十种，它们是研究受体特性的非常有用的工具，部分在临床治疗上已得到应用，并显示出具有一定应用前景。［D-Arg1,Trp7,9,Leu11-Substance P］ 被认为是SP受体拮抗剂［2，39，40］，它与SP受体竞争性结合，抑制其与内源性SP结合，从而削弱了内源性SP的作用。有人采用SP受体拮抗剂研究SP对胃运动功能的影响,如曲瑞瑶等［19］于中枢神经系统内注入SP拮抗剂后，发现未能完全阻断内源性SP引起的平滑肌收缩的作用，推测其原因可能是还有其他神经递质的释放，亦或平滑肌上存在多种速激肽受体亚型，因而不能完全阻断内源性SP的作用。牛淑冬等［40］在尾核中注入SP后，可见家兔胃运动及胃电慢波频率及波幅下降，注入SP后再予电针，进一步加强了电针对胃活动的抑制效应。但在尾核中注入SP拮抗剂（DADTL）后再予电针，却部分阻断了电针的抑制效应，认为尾核中SP能加强电针足三里对胃电的抑制作用。
本研究发现，针刺足三里使胃电慢波振幅及快波峰簇数升高。静滴SP拮抗剂后上述指标下降，静滴SP拮抗剂再行电针足三里后，上述测定值则均有所回升，但仍未恢复至给药前水平，显示电针能部分取消外周SP拮抗剂对胃电的抑制效应。本研究还发现，电针足三里使SP升高同时，胃窦组织内MTL也有所升高，使用SP拮抗剂后，胃窦内MTL含量未见升高。拮抗剂加上电针足三里穴除部分取消SP拮抗剂对胃电抑制效应外，也伴随胃窦MTL、SP升高。由以上进一步提示，针刺足三里对胃运动的调节并非单一一种脑肠肽在起作用。上述效应的出现可能是多种神经肽调整作用的综合效应。电针对胃运动影响可能是通过肽能神经释放多种肽类物质共同作用的结果。周吕［41］证实阻断胆碱能和肾上腺能神经后，不能完全阻断针刺对胃运动的影响。笔者以往研究发现，胆碱能M受体阻断剂未能完全取消电针对胃电活动的兴奋效应，推测实现针刺效应的外周通路既与经典神经通路有关，又与肽能神经有关［36］。肽类物质与经典递质可共同存在于同一神经末梢，它们同时或分别作用于同一或不同受体。SP受体阻断后，针刺还可激活其他脑肠肽，如MTL等使被抑制的胃电得以恢复。
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作者单位：410007 湖南长沙，湖南中医药大学针灸推拿学院