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【摘要】 目的 探讨维生素E在噪声暴露引起的大白鼠听力损伤有明显的保护作用及机制。方法 以听阈、耳蜗基底膜铺片及免疫荧光染色为指标，观察大白鼠在稳态噪声持续暴露之前30天至暴露后7天，灌维生素E或生理盐水，对大白鼠听觉脑干电位分析和耳蜗外毛细胞（OHC）丢失率分析及NF-κB在耳蜗毛细胞中表达定量分析。结果 维生素E在噪声暴露后大白鼠听力阈值明显低于单纯噪声组，OHC丢失率也明显降低，免疫荧光染色结果显示VitE干预组的耳蜗细胞表达NF-κB的强度低于单纯噪声组（P＜0.05）。结论 维生素E在噪声暴露引起的大白鼠听力损伤有明显的保护作用，通过上调耳蜗毛细胞中NF-κB的表达。
【关键词】 噪声； 耳蜗; 毛细胞；维生素E；NF-κB
The regulation of the cochlea hair cell NF-κB expression by the vitamin E for the noise
JU Shan-de,WANG Ping,DU Bao-dong.Department of ENT,Qian wei Hospital Changchun 130012,China
【Abstract】 Objective To discuss the protection and mechanism of vitamin E in the rats hearing impairment induced by noise exposure.Methods Take the audibility threshold、basilar membrane stretched preparation and immunofluorescence stain as the index, observing that the rats were put in the stationary noise before 30days until after that for 7days, have vitamin E and sodium chloride , check the auditory brain stem potential and the lost rate and NF-κB of the OHC in the cochlea hair cells expression quantitative analysis.Results After the noise exposure, the rats which have vitamin E have significant lower auditory acuity threshold than the purely noise exposure, and much lower lost rate of OHC.Immunofluorescence stain demonstrate that the group have vitamin E have lower intensity of NF-κB expression in the cochlea hair cells, （P<0.05）.Conclusion Vitamin E has obvious protection in the hearing impairment of rats, working out by up-regulation of NF-κB expression in the cochlea hair cells.
【Key words】 noise; cochlea; hair cell; vitamin E; NF-κB
噪声可产生可恢复的暂时性阈移（TTS）或不可恢复的永久性阈移（PTS），甚至造成噪声性耳聋。对噪声性听力损伤机制迄今尚无明确报道。本实验在大白鼠噪声暴露前30天至暴露后7天灌胃维生素E，对其防止TTS转变为PTS及促进听力恢复有无保护作用进行探讨。分析维生素E干预噪声听觉损伤与耳蜗毛细胞中NF-κB表达的关系，确定VitE减少噪声引起的毛细胞死亡的分子机制。
1 材料与方法
1.1 动物分组与处理 选择鼓膜正常, 听觉脑干电位仪测4000Hz频率双耳听阈在23～28dB的健康雄性Wistar大白鼠36只，体质量180～200g（购自高新开发区实验动物中心，清洁级）；随机分为3组；正常组12只（24耳），维生素E组12只（24耳），单纯暴露组12只（24 耳）。维生素E组在暴露前30天至暴露后7天连续灌胃［4mg/（kg·d）］。单纯暴露组在暴露前30天至暴露后7天连续灌胃生理盐水［5ml/（kg·d）］。 噪声暴露：连续用药30天后即行噪音暴露，将动物置于小笼内（40cm×30cm×30cm ），每笼2只，放入暴露舱（0.5m×1.5m×0.5m），用UZ-3型噪声发生器发生， A-K200功率放大器放大，有位于暴露舱四周的扬声器向暴露舱播放。暴露时用声压计进行连续监测，噪音保持在频率为4000Hz，平均声强为116dB SPL（sound pressure level）。动物暴露范围内声扬不均匀度为±2dB。持续暴露6h。
1.2 听阈测试 测试在隔音屏蔽室内进行，10%水合氯醛（330mg/kg）腹腔注射，麻醉生效后安插针式电极，记录电极的安装是用不锈钢针刺入前颅顶正中穿透皮肤至颅骨骨膜，置于冠状缝中点处，同时给声耳及对侧耳后皮下分别刺入不锈钢针，作为参考电极和接地电极。TDH-39型耳机给声，声源距耳廓1cm，诱发电位用信号处理机叠加处理，进行测试：刺激声为交替短声（clicks），重复率10次/s。实验选用主要参数为：带道滤波为32Hz～3kHz，扫描时间为10ms，叠加为512次。测试声强由110dB SPL开始，接近阈值后按5dB SPL渐档递减，电生理反射由针式电极引出，经放大及处理后以波形的方式显示于荧光屏，阈值是以肉眼刚能辨认的脑干电位波群中以Ⅲ波的声强表示。
1.3 耳蜗基底膜铺片 三组动物完成最后一次听阈测试后（噪声暴露停止后第7天）处死动物立即取出颞骨,打开听泡,4%甲醛固定24h,10%EDTA脱钙1周,分离出基底膜, 三组动物随机抽出各6只（12耳）,在常规苏木素染色,在放大400倍的光学显微镜下，以目镜中0.24mm显微测微尺为测量尺度，逐个视野从蜗底向蜗顶进行OHC记数。以OHC境界模糊或消失、细胞碎裂或缺失为OHC死亡标志。钩部和蜗尖各有4个视野不做记数。所得数据分析OHC损失分布情况。
1.4 免疫荧光染色 三组动物基底膜各6只（12耳），用0.1mol/L PBS洗涤3次，每次5min，加入0.1% Triton X-100处理15min，5%羊血清封闭1h，加入一抗（NF-κB 工作浓度1：100），室温孵育1h，用0.1mol/L PBS洗涤3次，每次15min，加入，Alexa Fluor555 Goat anti-rabbitIgG（工作浓度1：400），室温、避光放置1h，0.1mol/L PBS洗涤3次，每次15min，轻轻摇动。弃掉洗涤液，最后样品均再用1g/ml的Hoechst 33342室温染色5min，甘油封片。用Fluoview FV 1000激光扫描共聚焦显微镜观察（PMT电压值为650，CA针孔值为160）。NF-κB阳性表达为红色荧光，细胞核为蓝色荧光。阴性对照实验中，用PBS代替第一抗体，排除非特异性的二抗结合。
1.5 统计学分析 采用Fluoview FV 1000激光共聚焦显微镜分析软件分析基因表达相对荧光强度，使用Sigma Stat.2.03（sigma）统计软件，采用one way ANOVA检验，P<0.05认为有统计学差异。
2 结果
2.1 ABR阈值 暴露组在噪声暴露前和噪声暴露结束后不同时间的听阈阈值见表1；结果表明,单纯暴露组和补VitE均有明显听力损失,表现为听阈上移（P＜0.01）,按完全随机设计多个样本均数比较的方差分析表明,噪声暴露结束后1h、1天、2天、3天、7天, 单纯暴露组和补VitE相比，除噪声暴露后1h相差不显著外（P>0.05），差异均有显著性（P＜0.05）,表1为两组动物在噪音暴露后阈值的恢复变化,可见噪声暴露后1h相差不显著外补VitE组ABR阈值恢复明显高于单纯暴露组。见图1。 表1 ABR阈值dB SPL注：相同时间与单纯噪声组比较，*P<0.01
2.2 耳蜗基底膜铺片毛细胞变化 耳蜗基底膜铺片苏木素胞核染色显色结果：正常组耳蜗HC形态正常，其3排OHC和内毛细胞（IHC）排列整齐，结构清晰，无缺失。补VitE在噪声暴露第7天OHC有散在缺失，且以第三排为主，单纯暴露组出现细胞境界模糊或消失，且在3排OHC中以第三排OHC损伤为重，缺失明显，第二排、第一排均有不同程度的缺失，IHC也有丢失。对耳蜗基底膜铺片进行全长OHC记数，绘制耳蜗图，观察其OHC损失分布情况，补VitE组OHC缺失率明显低于单纯暴露组（P＜0.05）。见图2、图3。
2.3 耳蜗毛细胞NF-κB的表达 单纯噪声组、VitE干预组以及正常组在暴露后7天处死动物，分离耳蜗基底膜，进行NF-κB表达定量分析。结果见表2，图4。VitE干预组的耳蜗毛细胞表达NF-κB的强度低于单纯噪声组。图1 各组ABR阈值的比较（dB SPL）表2 维生素E对噪声暴露后耳蜗毛细胞中NF-κB表达的影响注：与单纯噪声组比较，*P<0.01
3 讨论
噪音对听觉的损伤是一个复杂的多因素的机制，各种因素又相互关联，相互影响。目前倾向于将噪声对听觉的损伤归纳为机械性、血管性和代谢性三个方面。超高强度130dB NHL以上的噪声对HC的损伤主要以机械损伤为主，中高强度110～130dB NHL噪声暴露以血管性和代谢性损伤为主。已经证实，强噪声刺激作用下耳蜗血管可发生一系列改变：血管痉挛收缩或扩张，血流速度变慢，局部血液灌注量减少；内皮细胞肿胀、通透性增加，血液浓缩粘滞度显著增高，血小板和红细胞聚集、血栓形成［1～5］；这些变化导致微循环障碍，耳蜗血流下降,内耳供血不足,内外淋巴液氧张力下降［6，7］。血管改变引起的局部缺血缺氧，造成了耳蜗内环境的代谢紊乱，HC代谢障碍，酶系统的功能障碍，从而细胞出现包括Corti器形态结构的损伤和声电转换的功能障碍等一系列病理生理改变。持续的噪声一方面使耳蜗血管收缩、微循环受损，局部缺血缺氧；另一方面导致耳蜗HC的ATP需要量、耗氧量以及耗葡萄糖量增加，出现局部相对缺血，自由基的增加及细胞内钙离子的超载，引起细胞结构、静纤毛、DNA及蛋白质的异常，导致细胞坏死及凋亡；强噪声尚可引起HC及支持细胞酶系统的严重紊乱，造成氧和能量代谢障碍。最近研究表明［8］，噪声引起代谢性损伤首先对两个结构产生破坏，一是可影响静纤毛结构，从而造成耳蜗微机械结构的改变，二是使IHC过量释放神经介质，从而影响神经传导。有研究表明，噪声暴露可破坏耳蜗的抗氧化体系，导致氧化和抗氧化失衡，从而在耳蜗产生大量活性氧自由基。过量的氧自由基可以攻击生物膜，使膜发生脂质过氧化（LPO），诱发LPO的大量产生，影响细胞内的重要生化反应，对耳蜗组织产生损伤。VitE通过自身被氧化成生育醌，从而将ROO-转变为化学性质不活泼的ROOH，中断脂类过氧化的连锁反应，有效抑制脂类过氧化作用，保护细胞免受不饱和脂肪酸氧化产生的毒性物质的伤害，在防止衰老、抗肿瘤等方面起着重要的作用。VitE本身具有产生酚氧基的结构，产生的酚氧基能够猝灭并能同单线态氧反应，保护不饱和脂肪酸免受单线态氧损伤。还可以被阴离子自由基和羟自由基氧化，使不饱和脂肪酸免受自由基攻击，从而抑制脂肪酸的自动氧化。VitE不仅对生物膜的结构和功能有较好的保护作用［9］，还能迅速捕捉自由基，生成的生育酚自由基又可进一步与另一个分子自由基反应生成非自由基生育醌，故抗氧化能力较强［10］。
NF-κB是一类具有多向转录调节作用的核蛋白因子，存在于多种组织的多种细胞中，具有广泛的生物学活性激活后参与许多基因的转录调控，在感染、炎症反应、氧化应激、细胞增生等过程中发挥作用。近年的研究表明NF-κB与细胞凋亡的关系密切，其参与多种凋亡相关基因的转录调控在肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用。多种细胞外刺激信号可激活NF-κB，如细胞因子IL-1，TNF-α及活性氧自由基等［11，12］，席恺等采用豚鼠耳蜗缺血-再灌注损伤模型，观察耳蜗组织形态功能变化与NF-κB、TNF-α表达的关系。结果发现，缺血组及缺血再灌注各组的NF-κB在耳蜗各转SV、IHC、OHC和SGC各部位表达随时间延长逐渐增强，再灌注24 h组达高峰。而TNF-α表达水平与NF-κB表达一致。认为耳蜗缺血过程中大量产生的活性氧刺激，NF-κB被激活，诱导TNF-α分泌增加，而缺血再灌注各组TNF-α水平加强，反过来会进一步激活NF-κB，形成恶性循环，加重缺血损伤的程度［13］。Fujioka 等采用RT-PCR方法分析噪声暴露后大鼠耳蜗组织细胞因子表达变化，发现噪声暴露后早期TNF-α、IL-1α和IL-6表达急剧增加［14］。我们的实验结果显示，噪声暴露后7天的耳蜗毛细胞中表达NF-κB的荧光强度明显强于正常耳蜗。我们推测噪声引起TNF-α增高，TNF-α与其特异性跨膜受体TNFR结合后，在胞质中形成肿瘤坏死因子受体相关死亡结构域（TRADD）受体，作用蛋白（RIP）肿瘤坏死因子受体相关因子（TRAF2）的复合物，诱导NIK表达，作用于IκB同时激酶IKK活化。在蛋白酶的作用下，磷酸化的IκB从p50/p65异源二聚体上降解进而p50/p65异源二聚体活化进入胞核中发挥转录活性，促进凋亡相关基因的表达，诱导细胞凋亡。我们发现NF-κB高峰表达时期，毛细胞形态学主要特征是核肿胀，而且有文献证实，此刻发生的细胞学改变，部分是可逆的，基于NF-κB与细胞死亡存在双向调节关系: 既可抑制细胞死亡也可促进细胞死亡，我们推测早期的NF-κB增高可能具有抑制细胞死亡作用，而耳蜗组织中持续高表达NF-κB则是促进细胞凋亡。Carcamo等的研究发现，VitE能够抑制培养的人类多种组织来源的细胞系NF-κB活性，通过抑制TNF诱导的NIK激活和IKK激酶活性［15］。在我们的实验中发现，VitC和GSH干预组耳蜗表达NF-κB水平与单纯噪声组没有明显差别，而VitE干预组的NF-κB表达水平与单纯噪声组相比明显降低。提示不同的刺激信号对NF-κB激活和信号通路不同，也可能VitC和GSH介导噪声保护的途径与VitE不同。Chen等在实验中见到增加细胞外谷胱甘肽水平时，能增加对TNF诱导NF-κB活化和对凋亡的耐受［16］，Carlson等应用维生素治疗脓毒血症，发现VitE能够通过降低NF-κB活性，抑制线粒体细胞色素C释放，接触细胞因子释放，改善心肌收缩功能。Calfee-Mason等研究发现饮食补充VitE能够抑制镇静安眠剂诱导的NF-κB激活［17，18］。
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作者单位：130012 吉林长春，吉林省前卫医院耳鼻咽喉科