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【摘要】 目的 研究大黄素对G蛋白耦联的钙敏感性调节影响的机制。方法 用酶解法分离大鼠胃平滑肌细胞，采用钙钳制技术控制平滑肌细胞内游离钙离子水平。 用图像分析系统测量平滑肌细胞长度。采用激光扫描共聚焦显微镜和免疫荧光技术分析RhoA在细胞内的时空分布变化。结果 大黄素在平滑肌细胞内游离钙离子水平固定时剂量依赖性收缩细胞。G蛋白降解产物GDP类似物GDPβs剂量依赖性对抗大黄素收缩胃平滑肌细胞作用。 C3-transferase（RhoA抑制剂）抑制大黄素引起的细胞收缩，大黄素可引起RhoA膜移位。 结论 大黄素对G蛋白耦联的钙敏感性调节有影响，并且是通过RhoA途径。
【关键词】 大黄素 胃平滑肌细胞 钙敏感性
To rsearch the mechanism of emodin influencing calcium sensibitity
WU bin， QI Qing-hui.Department of Transplantation,The First Center Hospital，Tianjin 300192,China
【Abstract】 Objective It has been noted that emodin can influence calcium sensibitity but its precise mechanism remains unsolved.To investigate how emodin influence calcium sensibitity.Methods Cells were isolated from the muscle layers of Wistar rat stomach by enzymatic digestion. Intracellular free calcium ions level of smooth muscle cell was controlled by the technique of calcium claw cell length was measured by computerized image micrometry. RhoA distribution at rest state or after stimulation was measured with immuoflurescence confocal microscopy.Conclusion Emodin can influence calcium sensibitity by the approach of RhoA route.
【Key words】 emodim;gastric smooth muscle cell;calcium sensibility
目前的研究表明平滑肌细胞的收缩机制为：（1）［Ca2+］i的升高：钙升高后，通过肌球蛋白轻链激酶（MLCK）途径磷酸化肌球蛋白轻链（MLC20）引发收缩。（2）钙敏感性的升高：这一机制是通过抑制肌球蛋白轻链磷酸酶（MLCP）的活性来实现的［1］。钙敏感性的增加使得在相同的［Ca2+］i浓度条件下，细胞可以产生更大的收缩力。调节钙敏感性的信号转导途径被认为是：激动剂通过G蛋白耦联受体激活RhoA（一种22-26-kDa的small GTPase），随之激活其下游的激酶ROK（RhoA kinase），磷酸化MLCP的调节亚单位，从而抑制MLCP的活性抑制MLC20脱磷酸化［2］。
大黄（Rhubarb）是通里攻下中药中的代表性药物，具有明确增强肠道蠕动的作用，被广泛用于急腹症的治疗中。大黄素是大黄的重要有效成分，为蒽醌类化合物，具有多种药理作用。Cheng等人的研究发现大黄素通过升高［Ca2+］i促进大鼠膈肌的收缩。林秀珍等研究表明大黄素可以促进离体肠道平滑肌条的收缩，杨文修等证实大黄素可促进细胞膜去极化，缩短膜电位振荡周期，增加峰电位发放频率，增加分节律收缩的幅值指数。
我们在之前的研究中已证实大黄素对大鼠胃平滑肌细胞有收缩作用，并也证实能够影响［Ca2+］i，但是否影响钙敏感性尚未证实，本实验将初步解决这一问题。
1 材料与方法
1.1 实验材料和仪器 健康成年Wistar大鼠（天津市医学实验动物中心提供），清洁级，雌雄各半，鼠龄3～4个月，体重（205±25）g，Emodin、GDPβs、GTPγs、C3-transferase、β-escin、DMEM（sigma）,一抗 mouse monoclonal anti-RhoA IgG（SANTA CRUZ）,二抗、抗体稀释液、Triton-100、多聚甲醛（北京中山生物公司），余试剂均为国产分析纯。Bio-rad Radiance2000型激光扫描共聚焦显微镜，超净工作台，细胞培养箱，Olympus倒置显微镜，Cmais2000图像分析系统，Naro超纯水系统。
1.2 实验方法
1.2.1 胃平滑肌细胞的分离 大鼠禁食2天,脱颈处死, 无菌操作取胃, 生理盐水彻底冲净, 刮去黏膜，将肌肉组织剪成约1～2mm3体积大小，放于15ml含胶原酶Ⅱ型（0.1%的胶原酶）的DMEM消化液中，37℃振摇约30min，吸出上清液，置于冰浴离心管中备用。同等条件下再消化一次，收集二次上清液离心，用DMEM再洗一次。最后重新悬浮于含15%～20%的胎牛血清和抗生素的DMEM培养液中。50目筛网过滤，收集细胞，调整细胞浓度。4%台盼蓝染色判断细胞活力在95%以上，细胞接种于培养瓶中，放入CO2孵箱培养。
1.2.2 可通透胃平滑肌细胞的制备 当酶消化过程完成后,将消化液吸出,并用细胞质缓冲液（mmol/L: NaCl 20,KCl 100,MgSO4 5,NaH2PO40.96,CaCl2 0.61,EGTA 1,2%BSA,pH 7.2）洗3次,洗液与消化液一起,1000r/min离心5min,弃上清,用2ml细胞质缓冲液悬浮沉淀,并吹打成细胞悬液。细胞分散后,加入75μg/ml的皂苷孵育4min,离心1000r/min 5min,沉淀重新悬浮于无皂苷含1.5mmol/L ATP,5mmol/L磷酸肌酸,10U/ml肌酸磷酸激酶的细胞质缓冲液中。
1.2.3 平滑肌细胞钙钳制技术 如上处理细胞后,根据Ca2+EGTA的平衡结合常数K进行计算,将高浓度（10mmol/L）和具一定Ca2+浓度的溶液按一定比例混合,可获得所需Ca2+浓度的溶液，将胞浆游离Ca2+浓度钳制在某一要求的水平，这样可以观察不依赖胞浆游离Ca2+浓度的细胞活动过程， 据国外文献报道我们把Ca2+浓度钳制在Pka=6.3这一最佳水平。 分四组：（1）大黄素；（2）大黄素+GDP类似物GDPβs；（3）GDP类似物GDPβs；（4）正常对照组。各组均分5个浓度梯度，大黄素组为1、5、10、50、100μmol/L；GDPβs组为10、50、100、500、1000μmol/L；大黄素+ GDPβs组为前两组浓度相应一一配伍而成。
1.2.4 平滑肌细胞收缩的测定 取0.25ml细胞悬液，加入相应浓度的实验试剂。30s后加入2.5%戊二醛终止反应。对照组加入相同体积缓冲液，亦于30s后加入戊二醛终止反应。应用图像分析系统测定平滑肌细胞长度，随机测定50个细胞的长度。平滑肌细胞的收缩反应的计算公式为：收缩变化百分数＝（用药组平均长度－对照组平均长度）／对照组细胞平均长度×100％。
1.2.5 免疫荧光共聚焦显微镜RhoA成像 收集按上述方法分散的细胞接种于六孔板中的盖玻片上，培养基为含20％胎牛血清的DMEM。用免疫荧光方法标记：4%多聚甲醛固定10min，用PBS冲洗3次，每次5min；然后0.2%Triton-100作用10min，PBS冲洗3次，每次5min；一抗mouse monoclonal anti-RhoA IgG 37℃孵育1h，PBS冲洗3次，每次5min；二抗Goat anti-Rabbit IgG FITC孵育1h，PBS冲洗3次，每次5 min；缓冲甘油封片，Bio-Rad Radiance 2000激光共聚焦显微镜检测，FITC激发波长为488nm，发射波长为520nm。空白对照组与第二抗体孵育。沿平滑肌细胞Z轴以0.4μm间距行断层扫描，收集各Z轴平面PKCα分布信息。设定膜周边区（peripheral）为细胞外围15%区域，其平均荧光强度值为P值，其余70%区域为胞浆区（cytosolic），其平均荧光强度值为C值。不同平面的P/C值代表RhoA在平滑肌细胞内的空间分布。
1.3 统计学方法 数据均以x±s表示，采用Student’s t-test方法进行统计处理。P<0.05提示差异有显著性。
2 结果
2.1 大黄素对胃平滑肌细胞长度的影响 （1）倒置显微镜下，分离的胃平滑肌细胞呈梭形，长度各异，有的处于舒张状态,有的处于不同的收缩状态下。细胞的长度在67～141μm之间，平均长度为（96.22±16.12）μm （见图1）。（2）实验结果显示大黄素对胃平滑肌细胞有收缩作用，并随浓度的增加收缩幅度明显增加；GDPβs对胃平滑肌细胞有舒张作用，并随浓度的增加舒张幅度明显增加；GDPβs并能抑制大黄素的收缩作用，也呈浓度依赖性（见图2，表1）。 各组间不同浓度间统计分析显示差异有显著性（见表2）。各浓度组间不同组间统计分析显示差异有显著性（见表3）。表1 各加药组对SMC收缩的影响（收缩变化百分比，％）表2 各组间不同浓度SMC平均长度（μm）的统计分析表3 各浓度不同组间SMC平均长度（μm）的统计分析
2．2 C3-transferase（RhoA抑制剂）对大黄素收缩作用的影响 为研究RhoA信号途径在大黄素收缩中的作用，我们分别使用C3-transferase（RhoA抑制剂）与结肠平滑肌细胞孵育，观测C3-transferase对大黄素收缩作用的影响。结果表明C3-transferase可明显抑制大黄素所引起的收缩反应，差异有显著性（P<0.05），见图3。
2.3 RhoA时空分布变化 如图4所示，在静息状态下，RhoA均匀分布于胞浆中，相应的各Z轴平面的P/C值均接近1。而在大黄素刺激后，RhoA的分布发生明显的变化。在接近细胞顶部和底部的Z轴切面上（平面1，2，11，12），RhoA仍接近均匀分布，P/C值变化不大。但在细胞中部的各Z轴切面上，P/C值明显增大见图5。静息时细胞中部的各Z轴切面的平均P/C值为0.94±0.09（n=10）,而大黄素刺激后P/C值增加至1.94±0.17，两组差异有显著性（P<0.05）。
3 讨论
研究表明调节平滑肌细胞收缩的细胞内信号转导机制有钙信号介导和非钙信号介导的两类。非钙信号介导的平滑肌细胞收缩的信号转导机制包括G蛋白耦联钙敏感性调节机制和细肌丝相关蛋白调节机制。
MLC20的磷酸化/非磷酸化是平滑肌细胞收缩的主要调节机制［4，5］。但研究发现平滑肌细胞的收缩并非与MLC20的磷酸化程度成比例，甚至在无MLC20的磷酸化的情况下，也可以引起平滑肌细胞收缩。通过对MLC磷酸化程度与［Ca2+］i不成比例这一现象的研究揭示了G蛋白耦联钙敏感性调节机制［５］。通过对平滑肌细胞的收缩强度与MLC磷酸化程度不成比例这一实验现象的研究揭示了细肌丝相关蛋白调节机制（thin filament-based regulatory proteins）。
G蛋白耦联钙敏感性调节机制具体如下：MLC的磷酸化是决定肌球蛋白ATP酶活性的重要分子开关。MLC20磷酸化的状态主要取决于MLCK 的活性,同时也受MLCP 活性的影响。传统学说认为,MLCK 对MLC20的磷酸化作用是钙依赖性的［3，4］。但近年来的体外研究已证明,高浓度的MLCK在无Ca2+ / 钙调蛋白（calmodulin, CaM） 存在时,也能使MLC20磷酸化, 这一现象产生的原因与无Ca2+ 时高浓度MLCK的自动磷酸化有关,该磷酸化发生于MLCK分子自动抑制区的第803 位苏氨酸上［6］，MLCP 由3 个亚基组成: 130 kD 的肌球蛋白结合亚基,38 kD 的催化亚基和20 kD 功能未明的小亚基。细胞内有多种途径可抑制MLCP 的活性,从而减少MLC20脱磷酸化,增强平滑肌的收缩活动。MLCK决定MLC的磷酸化，而MLCP可使MLC脱磷酸化。MLCK和MLCP的协同作用决定了MLC的磷酸化程度。G蛋白耦联的钙敏感性调节就是通过调节MLCP活性而改变收缩单元对钙的敏感性的一种调节方式［7］：激动剂通过G蛋白耦联受体激活RhoA（一种22-26kD的small GTPase）,随之激活其下游的激酶ROK（RhoA kinase）, 磷酸化 MLCP调节亚单位，从而抑制MLCP的活性抑制MLC20的脱磷酸化［7］。
由上可知平滑肌细胞的收缩机制一为［Ca2+］i的升高，二为钙敏感性的升高。本实验通过平滑肌钙钳制技术将细胞内钙离子钳制在某一最佳浓度，这样我们研究的细胞收缩都是通过影响细胞的钙敏感性来实现的。我们通过对大黄素组、大黄素+GDP类似物GDPβs、GDP类似物GDPβs、正常对照组这四组进行组间及组内不同浓度进行比较，实验结果显示大黄素对胃平滑肌细胞有收缩作用，并随浓度的增加收缩幅度明显增加，呈浓度依赖性；单独应用GDPβs对胃平滑肌细胞有舒张作用，并随浓度的增加舒张幅度明显增加，也呈浓度依赖性；GDPβs与大黄素同时应用显示其能拮抗抑大黄素对细胞的收缩作用，同样也呈浓度依赖性。这就说明大黄素能通过影响GDP起作用。我们还发现使用RhoA抑制剂C3-transferase可明显抑制大黄素的收缩作用，C3-transferase组与对照组有明显差异，也提示钙敏感性调节也是大黄素发挥收缩作用的重要机制。激光扫描共聚焦显微镜和免疫荧光技术分析显示RhoA在平滑肌细胞内的时空分布发生明显变化：静息状态下RhoA主要分布在细胞浆内，当应用大黄素刺激后可引起RhoA由胞浆向胞膜的移位，主要分布在细胞膜上了。这也进一步证明了大黄素收缩平滑肌细胞机制中包括钙敏感性调节。
以上我们的研究结果表明：大黄素对G蛋白耦联的钙敏感性调节有影响，并且是通过RhoA途径。
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作者单位：300192 天津，天津市第一中心医院移植学部（Δ通讯作者）