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【摘要】 目的 评价结核杆菌复苏因子的免疫能力。方法 取65例结核病人血淋巴细胞1640培养，复苏因子蛋白质刺激3天，对照不加复苏因子蛋白，MTT法分析淋巴细胞增殖量。结果 复苏因子刺激的结核病人组血淋巴细胞均有不同程度的增殖，与对照组比较差异有显著性(P<0.01)。结论 复苏因子蛋白质具有较强的免疫原性
【关键词】 结核杆菌;复苏因子;免疫能力
The external stimulation of resuscitation promoting factor of mycobacterium tuberculosis on lympholeukocyte
LUO Kai-jun, WANG Xiao-hong, HOU Juan.Medical College of Jishou University, Hunan 416000,China
【Abstract】 Objective To evaluate the immunity of the resuscitation promoting factor of mycobacterium tuberculosis.Methods 65 blood lymphocytes of tuberculosis was cultured with 1640, we stimulated the three days with the resuscitation promoting factor, control without the resuscitation promoting factor protein, and MTT analysis of the amount of lymphocyte proliferation.Results The stimulation of blood lymphocytes of TB patients with resuscitation promoting factor had varied degrees of proliferation as compared with the control group significantly (P<0.01).Conclusion The resuscitation promoting factor protein has a strong immunogenicity.
【Key words】 mycobactreium tuberculosis;resuscitation promoting factor;immunocompetence
结核分枝杆菌复苏因子蛋白质是迄今为止唯一能使休眠结核分枝杆菌复苏的蛋白质，研究表明[1]结核分枝杆菌复苏因子蛋白质(Rpf)亚单位疫苗在小鼠试验中有很高的免疫反应，除Rpf C外，均能诱导产生抗体IgG1和IgG2α、γ-IFN、IL-10、IL-12，促进T细胞增殖。因此，我们应用Rpf刺激结核病人血淋巴细胞分析淋巴细胞增殖率，研究Rpf的免疫原性，为结核分枝杆菌新疫苗的研究提供证据。
1 资料与方法
1.1 一般资料 65例肺结核病人，经X线检查，痰细菌学培养和细菌学鉴定，确诊为结核病患者，均符合国家卫生行业标准中WS 288-2008肺结核诊断标准，其中男30例，女35例，年龄28～60岁。
1.2 材料 结核杆菌复苏因子蛋白由北京胸科医院惠赠。 淋巴细胞分离液、四甲基偶氮唑盐(MTT)均购自晶美公司。
1.3 方法 取结核病人外周血5ml，EDTA抗凝，淋巴细胞分层液分离淋巴细胞。1640溶解淋巴细胞，稀释为107/ml。取96孔板，加入 107/ml的淋巴细胞200μl，加入复苏因子蛋白质使其终浓度为121nM，对照组不加，37℃CO2孵育3天。每孔加入20μl 5g/L噻唑蓝(MTT),培养4h，吸去上清，沉淀加入150μl DMSO，振荡10min，570nM比色。
1.4 统计学方法 结果采用t检验。
2 结果
复苏因子刺激的结核病人血淋巴细胞均有增殖，增殖率为100%，与对照组比较差异有非常显著性，P<0.01，见表1。
3 讨论
机体免疫系统中淋巴细胞增殖是机体对非己抗原刺激产生免疫应答过程中的重要事件，淋巴细胞增殖结果表现为产生效应淋巴细胞,清除非己抗原,维护机体内环境稳定。表1 复苏因子刺激的结核病人血淋巴细胞增殖试验
1998年Mukamolova在细菌因子一文中首先提出了复苏因子(Resuscitation promoting factor ，RPF)的新概念[2]，并证实复苏因子是由有活性的微球菌分泌的一种蛋白质，它在皮摩尔级浓度就能有效的促进休眠的非生长同源菌的复苏和生长。Yeremeev[1] 证实Rpf亚单位疫苗在小鼠试验中有很高的免疫反应，除Rpf C外，均能诱导产生抗体IgG1和IgG2α、γ-IFN、IL-10、IL-12，促进T细胞增殖，而不产生IL-4、IL-5。体液免疫和T细胞免疫显现出高度的交叉反应。复苏因子亚单位疫苗在接种大剂量的毒力结核杆菌H37Rv小鼠中表现有明显的保护水平，在小鼠肺脏和脾脏中结核杆菌的繁殖和生存时间都受到抑制。Radaeva TV[3]通过对结核病复燃的易感小鼠(I/st)模型试验发现：治疗型疫苗BCG对小鼠的结核病复燃没有保护力，是因为科赫现象的原因;但预防复燃型疫苗Rpf蛋白家族，能诱导小鼠通过CD4+ T细胞产生γ-IFN，并且能轻微的减少小鼠脏器内结核菌的增殖。但二种疫苗都不能阻止小鼠结核病的复燃。总之，结核分枝杆菌疫苗在小鼠体内能产生很强的免疫反应。
MTT法[4]是基于氧化-还原反应原理，当细胞或细菌增殖时，MTT能产生颜色变化。分光光度仪比色检测其OD值，来判断细胞或细菌的增殖率。
我们的试验表明，结核分枝杆菌复苏因子刺激结核病人血淋巴细胞能产生很强的免疫应答。引淋巴细胞大量转化增殖，与不加抗原刺激的对照组比较差异有非常显著性，P<0.01。表明复苏因子蛋白质具有很好的免疫原性，可以作为新一代的结核分枝杆菌疫苗。
【参考文献】
1 Yeremeev VV, Kondratieva TK, Rubakova EI, et al. Proteins of the Rpf family: immune cell reactivity and vaccination efficacy against tuberculosis in mice.Infect Immun. 2003,71(8):4789-4794.
2 Mukamolova GV,Kaprelyants AS,Young DI,et al.A bacterial cytokine.Proc Natl Acad Sci SA,1998,95(15):8916-8921. PMID: 9671779.
3 Radaeva TV,Nikonewnko BV,Kapina MA,et al. Experimental approaches to designing vaccines against tuberculous infection reactivation. Probl Tuberk Bolezn Legk，2006,(5):45-48.
4 Montoro E,Lemus D,Echemendia M,et al.Comparative evaluation of the nitrate reducetion assay,the MTT test,and the resazurin microtitre assay for drug susceptibility testing of clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis.J Antimicrob Chemother,2005,55:500-505.